張振華 宋 健 孟凱強(qiáng) 胥 冰 王 斌 沈舒文 張瑞凡 王紫慧 蘇 輝王 卓 馮天照陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712046

隨著中藥藥理學(xué)對(duì)中藥有效成分及作用蛋白研究的不斷加深，中藥在抗菌、抑菌方面的顯著療效逐漸被展示。宋健副教授科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)現(xiàn)代工藝技術(shù)，對(duì)名老中醫(yī)沈舒文教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑—蘭艾雙香方，進(jìn)行了中藥新劑型改良，作為新型消毒劑。通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘，檢索蘭艾雙香方的有效成分及對(duì)應(yīng)蛋白，建立數(shù)據(jù)庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行分析，共獲得蘭艾雙香方蛋白265個(gè)；其中“MG1655”樣品中共有17個(gè)作用蛋白，“W3110”樣本中有5個(gè)作用蛋白，fhuA（ferrichrome outer membrane transporter）是在大腸桿菌K12抑菌過(guò)程中誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵蛋白，提示蘭艾雙香方中存在的鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腸桿菌鐵死亡進(jìn)程中發(fā)揮作用。為后續(xù)開(kāi)展中醫(yī)藥抑菌、抗菌作用的研究提供了一定基礎(chǔ)。

隨著中藥藥理學(xué)的發(fā)展，對(duì)中藥有效成分及作用蛋白的開(kāi)發(fā)和研究不斷加深，已證實(shí)如藤梨根、藿香、羌活、艾葉等中藥中的酚類、黃酮類、生物堿類、萜類等多種單體化合物有明顯抗菌作用。中藥在抑菌方面的療效十分顯著，劉繼敏等[1]開(kāi)發(fā)的以苦參、蛇床子、甘草、冰片、薄荷腦為原料的奧膚舒消毒液主要針對(duì)白念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，通過(guò)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)以上三種常見(jiàn)致病菌有明顯抑制作用。馮立民等[2]開(kāi)發(fā)的以苦參、蛇床子、大黃等水煎提取液加芳香油制成的消毒液在抑菌試驗(yàn)中對(duì)常見(jiàn)致病菌有明顯作用。冼桂江等[3]以中藥黃柏、蛇床子水煎提取液配合氯己定的懸濁液作為中藥消毒液通過(guò)在懸液定量殺菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其有明顯的抑菌效果。蘭艾雙香抑菌消毒液是針對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌消毒液，該消毒液是以抑菌中藥復(fù)方蘭艾雙香方為基礎(chǔ)，通過(guò)現(xiàn)代蒸餾提純等技術(shù)，在國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)的支持下，設(shè)計(jì)并完成的中藥新劑型改良項(xiàng)目。其組成為羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、半枝蓮、佩蘭和艾葉，該方是名老中醫(yī)沈舒文教授與宋健副教授豐富中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的凝練，多年來(lái)一直作為治療細(xì)菌感染的臨床基礎(chǔ)方。

鐵死亡（ferroptosis）是指主要依賴于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧（L-ROS）和鐵累積所引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程。Dolma等[4]在2003發(fā)現(xiàn)了一種不伴有細(xì)胞核形態(tài)改變、DNA斷裂以及半胱天冬酶激活的新細(xì)胞凋亡模式的新化合物“Erastin”，并且發(fā)現(xiàn)這一細(xì)胞凋亡過(guò)程不能被（如半胱天冬酶抑制劑等）凋亡抑制劑抑制。Dixon等[5]于2012年將該細(xì)胞凋亡過(guò)程正式命名為“鐵死亡”，是一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞凋亡形式。促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的誘導(dǎo)方式多種多樣，包括p53質(zhì)粒包裹金屬有機(jī)網(wǎng)絡(luò)的MON-p53[6]、納米氧化鐵[7]、FePt納米粒子[8]、?；o酶A合成長(zhǎng)鏈家族成員4（ACSL4）[9-10]等。除此之外，相關(guān)方劑和中藥也可導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生，如黃芩湯、四物湯、淫羊藿、干姜、高良姜、麥冬、花椒、青蒿等。

本研究通過(guò)對(duì)蘭艾雙香方進(jìn)行分子層面的討論，探究其在大腸桿菌K12抑菌過(guò)程中誘導(dǎo)大腸桿菌K12鐵死亡的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

分別以“羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、半枝蓮、佩蘭和艾葉”十二種物質(zhì)檢索中國(guó)知網(wǎng)及中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）等，對(duì)蘭艾雙香方的有效成分及蛋白進(jìn)行收集整理。以“Iron Death”在Uniptot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索鐵死亡相關(guān)蛋白，該結(jié)果將作為鐵死亡的相關(guān)蛋白。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所選復(fù)方蘭艾雙香方蛋白對(duì)應(yīng)的有效成分需同時(shí)滿足口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18兩個(gè)條件；②鐵死亡相關(guān)蛋白需為大腸桿菌K12物種，剔除其他物種的鐵死亡相關(guān)蛋白；③所有組別的蛋白需刪除該組重復(fù)項(xiàng)內(nèi)容，多次出現(xiàn)按照一次計(jì)算，不做出現(xiàn)頻次的累積。

1.3 數(shù)據(jù)錄入和標(biāo)準(zhǔn)化

將所有涉及的蛋白質(zhì)名稱以及基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，運(yùn)用國(guó)際專用縮寫，如“Ferrichrome outer membrane transporter”“Ferric hydroxamate receptor”“Ferric hydroxamate uptake”“Ferrichromeiron receptor”“JW0146”統(tǒng)一規(guī)范為“fhuA”。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選蘭艾雙香方中對(duì)大腸桿菌鐵死亡起作用的蛋白，對(duì)特定蛋白的作用進(jìn)行分析。構(gòu)建蘭艾雙香方核心蛋白與其他蛋白之間的蛋白網(wǎng)絡(luò)，并分析其作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共收集得到蘭艾雙香方的化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為指標(biāo)進(jìn)行篩選，得到復(fù)方中共138個(gè)活性化學(xué)成分，包括羌活（15個(gè)）、獨(dú)活（9個(gè)）、石菖蒲（4個(gè)）、藿香（11個(gè)）、蒼術(shù)（9個(gè)）、丁香（6個(gè)）、薄荷（10個(gè)）、貫眾（7個(gè)）、苦杏仁（19個(gè)）、半枝蓮（28個(gè)）、佩蘭（11個(gè)）和艾葉（9個(gè)）的化學(xué)成分；結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)將有效成分的對(duì)應(yīng)蛋白進(jìn)行整理，共獲得蘭艾雙香方蛋白265個(gè)。

2.2 藥物針對(duì)大腸桿菌K12作用蛋白篩選結(jié)果

將蘭艾雙香方265個(gè)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），物種選擇“Escherichia coli K12”兩個(gè)不同的樣本“MG1655”和“W3110”，分別獲得在兩種不同的大腸桿菌K12的作用蛋白，“MG1655”樣品中共有17個(gè)作用蛋白、“W3110”樣本中有5個(gè)作用蛋白，見(jiàn)圖1～2。

圖1 大腸桿菌K12（MG1655）

圖2 大腸桿菌K12（W3110）

2.3 鐵死亡過(guò)程中核心基因篩選

將蘭艾雙香方和大腸桿菌鐵死亡兩組蛋白準(zhǔn)備好后，導(dǎo)入Jvenn中，作出兩者的交集[11]，即為本研究核心蛋白，僅有1個(gè)核心蛋白—fhuA，fhuA蛋白是在大腸桿菌K12抑菌過(guò)程中誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵蛋白。

3 討論

fhuA蛋白為鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與鐵鉻（一種異羥肟酸鹽型鐵載體）復(fù)合參與鐵的吸收，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵鉻鐵穿過(guò)外膜；除了在鐵色素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用外還可轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素白霉素，是鐵色素的結(jié)構(gòu)類似物，并作為大腸桿菌素M、小菌素J25和噬菌體T1、T5、phi80和UC-1的受體[12-14]，其二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3～4。

圖3 fhuA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 fhuA結(jié)構(gòu)示意圖

蘭艾雙香方中多種中藥均有明顯抑菌作用，李美雎等[15]通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)青海不同產(chǎn)地寬葉羌活均存在特異的抗菌活性，可作為寬葉羌活抗菌藥物開(kāi)發(fā)物質(zhì)基礎(chǔ)。王小云等[16]通過(guò)抑菌試驗(yàn)發(fā)其化合物羌活揮發(fā)油對(duì)銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。劉杰等[17]發(fā)現(xiàn)佩蘭提取的黃酮成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等具有一定的抑菌作用。賀富胤等[18]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物對(duì)獼猴桃潰瘍病菌產(chǎn)生抑菌作用的較佳提取工藝，且同條件下，復(fù)配物有更強(qiáng)的抑菌作用。曾婷等[19]通過(guò)正交試驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)佛手、艾葉、廣藿香和云木香配比為2∶1∶4∶2時(shí)，該配方具有良好抑菌效果，并且以該處方為基礎(chǔ)研發(fā)了一款新型抑菌香皂。蘭艾雙香方的藥物為具有抑菌作用的常用中藥，該方也是細(xì)菌感染的臨床常用方，在臨床中有明顯療效。

中藥可通過(guò)多種成分在多種途徑發(fā)揮抑菌作用，復(fù)雜的抑菌途徑難以明確其準(zhǔn)確的抑菌過(guò)程，本研究通過(guò)對(duì)大腸桿菌K12菌株的鐵死亡過(guò)程進(jìn)行研究，擬發(fā)掘蘭艾雙香方在催化大腸桿菌進(jìn)行鐵死亡過(guò)程中產(chǎn)生作用的蛋白。通過(guò)數(shù)據(jù)發(fā)掘的方式，發(fā)現(xiàn)蘭艾雙香方中存在的鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腸桿菌鐵死亡進(jìn)程中發(fā)揮作用，為后續(xù)開(kāi)展誘導(dǎo)常見(jiàn)大腸桿菌等常見(jiàn)致病菌發(fā)生鐵死亡從而發(fā)揮抑菌作用提供了基礎(chǔ)。