李聰聰，姚玉峰，張傳珍

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025

銅 綠 假 單 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）屬于革蘭陰性桿菌，是一種重要的條件致病菌［1-2］，可在免疫功能低下或有其他易感條件的患者中引起廣泛的急性和慢性感染，除了常見的傷口感染、呼吸道感染與尿路感染外，還可進入血液引起菌血癥和敗血癥［3］。治療銅綠假單胞菌感染的常用抗生素有氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類等，其中環(huán)丙沙星是使用最廣泛且最有效的氟喹諾酮類藥物［4-5］。然而，隨著抗生素的濫用，臨床分離的銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星耐藥的比例越來越高，使得該抗生素的有效性不斷受到考驗。

銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的耐藥機制主要有2種，即靶位基因突變和外排泵（efflux pump）過表達。環(huán)丙沙星靶向DNA 解旋酶（DNA gyrase）和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ（topoisomerase），編碼這兩者的基因分別為gyrAB和parCE，其突變會導(dǎo)致環(huán)丙沙星與靶蛋白親和力降低［6］。除了靶位修飾，外排泵過表達也是銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的主要耐藥機制。其中MexEF-OprN 是一套臨床上常見的過表達可導(dǎo)致環(huán)丙沙星耐藥的外排系統(tǒng)，其過表達常由編碼其特異性調(diào)節(jié)蛋白的基因mexS突變介導(dǎo)。該外排泵的底物除氟喹諾酮類抗生素外，還包括氯霉素。此外，與MexEF-OprN 呈負共調(diào)控關(guān)系的孔道蛋白OprD 是亞胺培南進入胞內(nèi)的重要通道，因此MexEF-OprN 過表達通常還會引起對這些抗生素的交叉耐藥［7］。

異質(zhì)性耐藥（heteroresistance）從廣義上來說，指的是在細菌分離物中存在一個或幾個亞群，與主要群體相比，它們對抗生素的敏感性顯著降低［8］，被認為是耐藥性形成的重要中間階段［9］。異質(zhì)性耐藥菌株中的耐藥亞群很難通過常規(guī)的方法檢測鑒定，這給臨床對異質(zhì)性耐藥菌引起的感染的診斷和治療帶來極大的困難。近年來，已有許多研究報道臨床抗生素治療失敗與異質(zhì)性耐藥有關(guān)［10］。

耐藥亞群的發(fā)生頻率與穩(wěn)定性是定義異質(zhì)性耐藥的重要因素。ANDERSSON 等［11］建議，將在8 倍最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）條件下耐藥亞群發(fā)生頻率大于10-7的菌株定義為異質(zhì)性耐藥菌株。耐藥亞群的穩(wěn)定性是指當(dāng)抗生素壓力消失時，部分被選擇的耐藥亞群保持穩(wěn)定耐藥性的能力。相比于不穩(wěn)定的耐藥性，穩(wěn)定的耐藥性帶來的適應(yīng)性代價（fitness cost）通常更低［11］，因此探究其背后的遺傳機制更具有臨床意義。

近年來針對銅綠假單胞菌異質(zhì)性耐藥的報道逐漸增多，包括頭孢菌素類［12］、碳青霉烯類［13-14］和多黏菌素［15］等多種抗生素，但對環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥仍少有報道，其背后的遺傳機制尚不清楚。闡明銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥機制對控制其耐藥發(fā)展、優(yōu)化抗生素治療方案都具有非常重要的意義。在本研究中，我們以源自醫(yī)院患者分離鑒定的227 株銅綠假單胞菌作為出發(fā)菌株，篩選并研究環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥，以期為臨床治療該菌引起的感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源 實驗菌株為從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院與附屬仁濟醫(yī)院分離鑒定的227 株銅綠假單胞菌。標準菌株P(guān)AO1（P.aeruginosa）來自本實驗室。

1.1.2 試劑與儀器 環(huán)丙沙星藥敏紙片（貨號2978568）購自O(shè)xide Limited 公司；MH 培養(yǎng)基（貨號28050）購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司；鹽酸環(huán)丙沙星（貨號A600310）、氯霉素（貨號A600118）購自上海生工生物工程有限公司；莫西沙星（貨號M843928）、美羅培南（貨號M861173）、亞胺培南（貨號R843845）購自上海麥克林生化科技有限公司；Easyspiral dilute 細菌涂布儀購自上海書俊儀器設(shè)備有限公司；Synergy 2 酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；細菌基因組抽提試劑盒（貨號DP302-02）購自天根生化科技有限公司；生物安全柜1300 series A2購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 圓盤擴散法 挑取單克隆菌落接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h。用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于MH 固體培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取環(huán)丙沙星藥敏紙片置于培養(yǎng)基中心位置，37 ℃培養(yǎng)48 h。如果抑菌圈內(nèi)存在明顯菌落則判定為潛在異質(zhì)性耐藥菌株。

1.2.2 肉湯稀釋法 用肉湯稀釋法測定MIC。無菌96 孔板內(nèi)加入100 μL MH 培養(yǎng)基，每組第一個孔不加。取100 μL 含有一定抗生素濃度的MH 培養(yǎng)基加入第一列與第二列中，并從第二列開始充分混勻后吸取100 μL 加入下一列，依次進行二倍梯度稀釋至倒數(shù)第二列，每組最后一列為無抗生素的對照孔。用MH 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)過夜菌液濃度至OD（600 nm）=1.0，并稀釋1 000 倍。將稀釋好的菌液加入含有梯度濃度抗生素的孔中，每孔100 μL，充分混勻后將96 孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。24 h 后取出讀取MIC，其值為無細菌生長的最小抗生素濃度。

1.2.3 群體譜型分析（population analysis profiling，PAP） 挑取單克隆接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液以10倍梯度稀釋至10-7，選擇適宜稀釋梯度涂布于含有不同濃度環(huán)丙沙星的MH 固體培養(yǎng)基上，每種抗生素濃度涂布3 個連續(xù)稀釋度的菌液，置于37 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)平板上克隆數(shù)與稀釋度計算耐藥亞群頻率，以抗生素濃度為橫坐標，耐藥亞群頻率的對數(shù)為縱坐標繪制半對數(shù)圖。

1.2.4 異質(zhì)性耐藥穩(wěn)定性檢測 通過將耐藥亞群在無抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，觀察耐藥性變化來判斷異質(zhì)性耐藥的穩(wěn)定性，一般需要連續(xù)傳代10 次以上［11，16］。挑取耐藥亞群單克隆，測定環(huán)丙沙星最低抑菌濃度記為MIC-1，同時挑取單克隆在無抗生素的MH 固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代14 次。挑取第14 次傳代的耐藥亞群單克隆，測定最低抑菌濃度記為MIC-14。比較MIC-1 與MIC-14，若無明顯差異，此耐藥亞群親本即為穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥菌株。

1.2.5 全基因組測序與分析 取過夜培養(yǎng)菌液，以1∶100 轉(zhuǎn)接至新鮮5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD（600 nm）=1 時離心收菌。使用細菌基因組抽提試劑盒抽提基因組DNA。使用Illumina 平臺De novo測序，對測序獲得的DNA小片段文庫進行拼接，獲得基因組圖譜。比較分析異質(zhì)性耐藥親本菌株與其耐藥亞群的基因組序列。

2 結(jié)果

2.1 異質(zhì)性耐藥菌株的初篩

利用圓盤擴散法對銅綠假單胞菌環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥進行初篩，若抑菌圈內(nèi)存在明顯克隆，則判斷其為潛在環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥菌株（圖1）。對這些菌株再次進行圓盤擴散法驗證，以增加初篩的可靠性。最終共有18 株被初步確定為潛在環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥菌株（圖2A）。

圖1 圓盤擴散法篩選平板Fig 1 Plates of disk diffusion

圓盤擴散法篩選異質(zhì)性耐藥的同時，測量抑菌圈直徑，并依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）制定的抗微生物藥物敏感性實驗操作方法和判斷標準對其敏感性進行劃分。227株菌中有142株（62.6%）表現(xiàn)為敏感，26 株（11.5%）表現(xiàn)為中介，59 株（26.0%）表現(xiàn)為耐藥。

2.2 異質(zhì)性耐藥菌株的復(fù)篩

2.2.1 異質(zhì)性耐藥的穩(wěn)定性檢測 為了確定異質(zhì)性耐藥的穩(wěn)定性，從每個異質(zhì)性耐藥菌株的抑菌圈內(nèi)挑取2 個盡可能靠近藥敏紙片的單克隆，測定其對環(huán)丙沙星的敏感性，并在無抗生素的MH 平板上連續(xù)傳代后，再次測定其對環(huán)丙沙星的敏感性從而判斷異質(zhì)性耐藥的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示共有11 株異質(zhì)性耐藥菌株的耐藥亞群表現(xiàn)出穩(wěn)定的耐藥性。這些菌株被標記為潛在的穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥菌株（圖2B），從它們的耐藥亞群中挑選表型穩(wěn)定且耐藥水平較高的一株用于進一步研究。

2.2.2 異質(zhì)性耐藥菌株的確認 圓盤擴散法雖然簡易高效，但存在一定假陽性率與假陰性率。因此，對于初篩得到的潛在穩(wěn)定異質(zhì)性耐藥菌株，通過PAP進一步驗證。實驗結(jié)果顯示，這11 株銅綠假單胞菌均符合ANDERSSON 等［11］提出的對異質(zhì)性耐藥的普遍定義，無假陽性出現(xiàn)（圖2C、3A）。

2.2.3 初篩效率的分析 為了確認初篩的有效性，從篩選結(jié)果中隨機挑選18 株潛在的非異質(zhì)性耐藥菌株，同樣用PAP 進行驗證。其中有15 株（83.3%）仍表現(xiàn)為非異質(zhì)性耐藥，另3 株（16.7%）則符合異質(zhì)性耐藥標準（圖2D、3B）。這一結(jié)果說明，圓盤擴散法在用于銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的異質(zhì)性耐藥篩選時靈敏度較低，存在一定的假陰性率。

圖2 檢測流程與主要結(jié)果Fig 2 Summary of tests performed and main results

2.3 異質(zhì)性耐藥菌株及其耐藥亞群的MIC測定

為探究耐藥亞群的耐藥性變化以及異質(zhì)性耐藥分布，通過肉湯稀釋法檢測了異質(zhì)性耐藥菌株及其耐藥亞群的MICCIP，結(jié)果見表1。11 株異質(zhì)性耐藥菌株中有10 株為環(huán)丙沙星敏感菌株（MICCIP≤0.5 μg/mL），其耐藥亞群的MICCIP相比親本株均上升8～64倍，并且均為對環(huán)丙沙星中介（MICCIP=1 μg/mL） 或耐藥（MICCIP≥2 μg/mL）菌株。值得注意的是，異質(zhì)性耐藥菌株親本株1595為一株環(huán)丙沙星耐藥菌，其耐藥亞群的MICCIP相比親本株升高了8倍，達到64 μg/mL，遠高于耐藥劃分標準。

表1 異質(zhì)性耐藥菌株與其耐藥亞群MIC（μg·mL-1）Tab 1 Susceptibilities of heteroresistant strain and its subpopulation（μg·mL-1）

2.4 異質(zhì)性耐藥親本株與耐藥亞群基因組差異分析

為了探究銅綠假單胞菌環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥背后的遺傳機制，通過二代全基因測序?qū)ふ耶愘|(zhì)性耐藥菌株與其耐藥亞群間的遺傳差異，再通過Sanger測序驗證，最終確定11株耐藥亞群中共有13處非同義突變，結(jié)果見表2。

表2 耐藥亞群突變基因與突變類型Tab 2 Mutant gene and mutant type of resistant subpopulation

圖3 PAP實驗結(jié)果Fig 3 Results of PAP

除mexS與gyrA這2 個已知與環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)的基因外，PA2632、fleQ與PAKAK_02255 也各在1 株菌中發(fā)生了突變。NtrC 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FleQ 是鞭毛生物合成過程中的主要調(diào)控因子，通過調(diào)控銅綠假單胞菌鞭毛和胞外多糖的生物合成，在其運動和生物被膜形成中發(fā)揮重要作用。PA2632 與PAKAK_02255 則 分 別 是PAO1 和PAK 中的潛在基因。目前尚無研究表明這3 個基因與銅綠假單胞菌環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)。我們通過構(gòu)建fleQ或PA2632 的缺失株并測定其對環(huán)丙沙星的敏感性，表明這2 個基因缺失并不影響PAO1 對環(huán)丙沙星的敏感性。值得注意的是，兼具環(huán)丙沙星耐藥與異質(zhì)性耐藥的菌株1595 中，沒有檢測到突變。

2.5 不同突變類型耐藥亞群的藥物敏感性差異

我們檢測了親本株及其耐藥亞群對其他臨床治療銅綠假單胞菌感染的常用抗生素的敏感性，除另一種氟喹諾酮類抗生素莫西沙星外（moxifloxacin，MXF），還測定了對氯霉素（chloramphenicol，CHL）以及對碳青霉烯類抗生素亞胺培南（imipenem，IPM）和美羅培南（meropenem，MEM）的敏感性。

從表1 中可以看出，發(fā)生mexS突變的耐藥亞群在產(chǎn)生環(huán)丙沙星耐藥的同時對莫西沙星和氯霉素的敏感性降低，已知這三者皆為MexEF-OprN 的外排底物，表明mexS突變可能通過增強外排泵表達從而介導(dǎo)對該類抗生素的耐藥。其中6655R、7318R、7500R、7637R 還會產(chǎn)生亞胺培南耐藥性，這可能是MexEF-OprN 與OprD 負共調(diào)控的結(jié)果。美羅培南敏感性在各突變株中無明顯變化，因為該抗生素雖然與亞胺培南同屬碳青霉烯類抗生素，但并不通過OprD進入細胞。發(fā)生gyrA突變的耐藥亞群7314R 與A601R僅對環(huán)丙沙星與莫西沙星耐藥，對亞胺培南與氯霉素的敏感性無明顯變化，這與靶位突變介導(dǎo)的氟喹諾酮類抗生素耐藥機制相符。

3 討論

銅綠假單胞菌因其高水平的固有與獲得性耐藥機制，導(dǎo)致治療其引起的感染愈發(fā)棘手。異質(zhì)性耐藥作為耐藥性發(fā)展的中間階段，更是極大地增加了治療難度。本研究篩選的菌株大部分來自重癥患者，他們中的大多數(shù)在院內(nèi)感染銅綠假單胞菌，這種高耐藥水平的條件致病菌導(dǎo)致患者后續(xù)治療與康復(fù)困難重重。還有一部分菌株來自慢性阻塞性肺炎、支氣管擴張等慢性感染患者。這些患者往往經(jīng)歷過長期的抗生素治療，異質(zhì)性耐藥可能是導(dǎo)致其治療失敗的一個重要原因。環(huán)丙沙星作為臨床治療銅綠假單胞菌感染的重要抗生素，目前少有關(guān)于銅綠假單胞菌對其異質(zhì)性耐藥的報道。因此，探究這些臨床銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的異質(zhì)性耐藥機制對于治療其感染具有重要指導(dǎo)意義。

異質(zhì)性耐藥菌株的篩選是研究銅綠假單胞菌異質(zhì)性耐藥的基礎(chǔ)。為了提高篩選效率，我們將圓盤擴散法作為初篩方法，PAP作為復(fù)篩方法，結(jié)合進行環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥菌株的篩選鑒定。NICOLOFF 等［17］針對包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種致病菌的異質(zhì)性耐藥篩選結(jié)果表明，圓盤擴散法作為篩選手段存在一定假陽性率與假陰性率。但在我們的初篩結(jié)果中僅有假陰性而沒有假陽性存在，這可能與圓盤擴散法在篩選異質(zhì)性耐藥時靈敏度較低有關(guān)。并且在初篩階段，我們利用圓盤擴散法對潛在異質(zhì)性耐藥菌株進行重復(fù)驗證，進一步降低了該方法的假陽性率。從篩選結(jié)果可以看出，將圓盤擴散法作為篩選異質(zhì)性耐藥的單一方法，雖然簡單快速，但存在一定的假陰性率，且易受操作因素的干擾。而圓盤擴散法與PAP組合篩選的方法既保證了較高的篩選效率，同時又提高了篩選結(jié)果的準確性，為后續(xù)研究異質(zhì)性耐藥機制提供保障。

通過全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，mexS是耐藥亞群中突變頻率最高的基因。該基因的失活突變可能通過使外排泵MexEF-OprN 過表達導(dǎo)致藥物敏感性變化，mexS突變株對其他抗生素的交叉耐藥性也間接證明了這一點。這并非首次報道外排泵過表達參與銅綠假單胞菌異質(zhì)性耐藥。JIA 等［12］針對頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥的研究發(fā)現(xiàn)，部分耐藥亞群的mexX表達量升高。MEI 等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌對亞胺培南異質(zhì)性耐藥的主要機制與外排泵MexAB 高表達有關(guān)。XU 等［18］則發(fā)現(xiàn)，亞胺培南異質(zhì)性耐藥菌株的耐藥亞群中mexE與mexY的表達量顯著提高，oprD表達量則降低。由此可見，外排泵過表達是銅綠假單胞菌異質(zhì)性耐藥的主要機制之一，而不同抗生素對應(yīng)的外排泵系統(tǒng)也不盡相同，這可能與外排泵的底物特異性有關(guān)。值得注意的是，銅綠假單胞菌中共有4 套外排泵可以泵出環(huán)丙沙星［19-20］，其中MexCD-OprJ 與MexEF-OprN 是2 套臨床上最常見的因過表達導(dǎo)致環(huán)丙沙星耐藥的外排泵，前者的過表達通常由其特異性調(diào)節(jié)蛋白NfxB 的突變產(chǎn)生［7，21］。但在我們篩選到的耐藥亞群中，沒有發(fā)現(xiàn)除mexS外的與外排泵相關(guān)的基因發(fā)生突變。為什么異質(zhì)性耐藥菌株更偏向于通過過表達MexEF-OprN 來產(chǎn)生耐藥亞群呢？推測可能是由于與其相比，過表達MexCD-OprJ 產(chǎn)生的適應(yīng)度代價更高，因此在實驗室條件下銅綠假單胞菌會盡量避免選擇這一“低性價比”的耐藥機制?？紤]到不同外排系統(tǒng)的過表達帶來的多重耐藥性有很大差異，進一步探究銅綠假單胞菌在應(yīng)對抗生素壓力時對外排泵的選擇偏好性對其臨床治療有重要參考意義。

本研究通過全基因組測序未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥菌株1595 的耐藥亞群中存在遺傳突變。目前尚無研究報道存在非遺傳機制導(dǎo)致的異質(zhì)性耐藥。由于二代全基因組測序技術(shù)存在讀長短且末端準確率低的缺點，我們將利用第三代全基因組測序平臺對1595 及其耐藥亞群的遺傳差異進行測序，與二代測序結(jié)果整合分析基因組之間的差異，從而闡明該菌中異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生機制。

異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象并不是一個新發(fā)現(xiàn)，其在多種致病菌中被廣泛報道，真菌及部分腫瘤細胞中也存在此類現(xiàn)象。因為缺乏快捷高效的檢測手段，異質(zhì)性耐藥在臨床上往往難以引起注意。但如果對異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象未能及時發(fā)現(xiàn)并給予有效治療，它將向完全耐藥轉(zhuǎn)化，最終引起治療失敗。本研究報道了銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象，并進一步探究了其背后的遺傳機制，為臨床感染治療提供了理論指導(dǎo)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

李聰聰、姚玉峰、張傳珍參與了實驗設(shè)計、論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LI Congcong，YAO Yufeng and ZHANG Chuanzhen. The manuscript was drafted and revised by LI Congcong，YAO Yufeng and ZHANG Chuanzhen. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-04-02

·Accepted：2022-05-22

·Published online：2022-07-28