劉宏強(qiáng)，陸艷青，高宇軒，王一云，王傳東，張曉玲

1.山西大學(xué)體育學(xué)院，太原 030006；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科，上海 200092；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，太原 030001

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA） 以滑膜炎癥、進(jìn)行性關(guān)節(jié)退變和功能喪失為特征［1-2］，是導(dǎo)致老年人關(guān)節(jié)疼痛、生活質(zhì)量惡化的主要原因。OA 關(guān)節(jié)軟骨的不可逆變性仍然是尚未解決的問(wèn)題。近年來(lái)，盡管干細(xì)胞修復(fù)軟骨的研究取得了很大進(jìn)展，但OA 病理環(huán)境仍然是軟骨再生的重要障礙［3-4］。既往研究表明， 炎癥細(xì)胞因子如白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)異常是影響關(guān)節(jié)病理發(fā)展的關(guān)鍵因素［3，5-6］，可通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），觸發(fā)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解［7］。因此，特異性抑制NF-κB 通路，減輕IL-1β 和TNF-α 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)OA 炎癥微環(huán)境，是延緩OA 治療過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨退化和促進(jìn)軟骨修復(fù)的潛在手段［8-9］。前期研究［10］表明，抑制IL-1β/NF-κB 表達(dá)可挽救間充質(zhì)干細(xì)胞（軟骨干細(xì)胞）的軟骨再生功能。腫瘤壞死因子受體 相 關(guān) 因 子 6 （tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）是連接天然免疫、促炎細(xì)胞因子和抗原受體與典型的NF-κB 途徑和IL-1 信號(hào)通路的接頭/支架蛋白，其重要功能是泛素化和修飾中間信號(hào)分子［11-15］。與健康人體相比，OA 患者軟骨細(xì)胞中TRAF6 的mRNA 和蛋白表達(dá)增高［16］。然而，目前為止，TRAF6 在OA 中的作用以及抑制TRAF6 對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力和凋亡的影響尚不清楚。

siRNA 由21～25 個(gè)核苷酸組成，以高度序列特異性的方式降解靶mRNA，可以特異性地抑制靶基因的表達(dá)［17］。2019 年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了首個(gè)siRNA 衍生療法，RNA 干擾（RNAi）介導(dǎo)的基因療法逐漸從研究領(lǐng)域向臨床應(yīng)用過(guò)渡。遞送siRNA材料類型有脂質(zhì)、聚合物、金屬、介孔二氧化硅和多孔硅；然而siRNA 在臨床的應(yīng)用仍然受到限制，主要是因?yàn)槿狈τ行У慕o藥系統(tǒng)［18］。在陽(yáng)離子聚合物領(lǐng)域，聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）已得到廣泛應(yīng)用［19］。商業(yè)化的PEI25kDa作為一種經(jīng)典的基因傳遞載體，因缺乏可生物降解的化學(xué)鍵（C-C 或C-N 鍵），細(xì)胞毒性大，不適合臨床使用［20-22］。本研究在無(wú)水厭氧環(huán)境中合成了帶有氨基甲酸酯鍵的小分子PEI 衍生物［23］，使鄰苯二甲醛的醛基與PEI（相對(duì)分子質(zhì)量1 800）的氨基反應(yīng)，形成可降解的亞胺鍵（-N=C-），命名為OPEI。本研究觀察OPEI 的細(xì)胞毒性及其在關(guān)節(jié)滑膜中的siRNA 轉(zhuǎn)染效率，探討利用OPEI 轉(zhuǎn)染TRAF6siRNA 抑制滑膜細(xì)胞中的IL-1β 信號(hào)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成 軟 骨 分化能力的影響，以期為臨床OA 軟骨修復(fù)提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 內(nèi)側(cè)半月板切除模型的建立

實(shí)驗(yàn)選用8周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量270～300 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號(hào)為SYXK （滬） 2017-0008。將動(dòng)物隨機(jī)分為OA 組（n=20） 和假手術(shù)組（n=10）。OA 組大鼠術(shù)前用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg賽拉嗪麻醉，剃毛消毒，切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，全層切開內(nèi)側(cè)半月板，切除半月板［24］。假手術(shù)組除半月板保持完好外，均接受相同的操作。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

1.2.1 細(xì)胞采集 原代滑膜細(xì)胞和BMSCs 取自相同來(lái)源的4周齡SD大鼠，體質(zhì)量65～75 g。大鼠BMSCs取自脛骨和股骨后段的骨髓。細(xì)胞采集方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［25-27］。細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基DMEM （HyClone，美國(guó)），加入10%熱滅活胎牛血清（Gibco，美國(guó)）和1%青霉素-鏈霉素溶液（HyClone，美國(guó)）。所有細(xì)胞均在37 ℃、含5%CO2的潮濕空氣中生長(zhǎng)，每隔3～4 d傳代1次。第4代細(xì)胞用于后續(xù)分析。

1.2.2 IL-1β 刺激的原代滑膜細(xì)胞模型檢測(cè) 原代滑膜細(xì)胞用IL-1β （20 ng/μL）刺激48 h 后，分別轉(zhuǎn)染Lipo2000/siNC（對(duì)照組）和Lipo2000/siTRAF6（實(shí)驗(yàn)組）48 h，Western blotting 檢測(cè)MMP13、TRAF6、t-p65、p-p65的表達(dá)并進(jìn)行定量分析。

1.2.3 大鼠BMSCs 向軟骨分化誘導(dǎo) 將大鼠的BMSCs 接種于12 孔板中，每孔接種1.5×107個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)2 h后，在含有地塞米松（100 nmol/L）、丙酮酸鈉（100μg/mL）、亞油酸（4.7μg/mL）、牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）、抗壞血酸2-磷酸（37.5 μg/mL）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（10 ng/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 OPEI及OPEI/siRNA復(fù)合物的制備

1.3.1 OPEI 的制備 反應(yīng)在無(wú)水厭氧環(huán)境中進(jìn)行（用高純氮?dú)獗Ｗo(hù)）。將0.5 mmol 的鄰苯二甲醛（Aladdin，中國(guó)）溶解在10 mL 無(wú)水甲醇（Sigma-Aldrich，美國(guó)）中，滴加到0.25 mmol 的PEI 1.8K（Aladdin，中國(guó)）中，溶解在10 mL 無(wú)水甲醇中。溶液室溫?cái)嚢?4 h后，用減壓旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去有機(jī)溶劑，殘?jiān)苡谏倭侩x子水中，轉(zhuǎn)入截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000 的透析袋中注射48 h，透析后溶液在-20 ℃下冷凍干燥48 h，得到最終的OPEI 產(chǎn)品，-40 ℃下存儲(chǔ)。

1.3.2 OPEI/siRNA 復(fù)合物的制備及表征觀察 將OPEI溶液以不同的質(zhì)量比（m/m分別為2、3、4、5、6、7、8、9 和10），加入siRNA 溶液中以制備OPEI/siRNA 復(fù)合物，然后在室溫下孵育30 min。用90Plus粒度分析儀（Brookaven Instruments，美國(guó)）測(cè)量形成的復(fù)合物的粒徑和Zeta電位。使用原子力顯微鏡系統(tǒng)（多模納米顯微鏡Ⅲa，DI 公司，美國(guó)）觀察復(fù)合物的形態(tài)。復(fù)合物的穩(wěn)定性通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以裸siRNA為對(duì)照。

1.4 細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖的檢測(cè)

1.4.1 MTT 法檢測(cè)復(fù)合物的細(xì)胞毒性 將原代大鼠滑膜細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，將2、5、10、15、20、30、50、75、100 μg/mL 的OPEI 載體或不同質(zhì)量比值（2∶1～10∶1）的OPEI/siRNA 復(fù)合物加入孵育，每個(gè)濃度或質(zhì)量比設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。孵育4 h 后，加入5 mg/mL PBS 溶解的MTT 溶液（20 μL/孔），37 ℃孵育4 h，棄去溶液，每孔加入150 μL 的DMSO，37 ℃搖動(dòng)震蕩10 min。酶標(biāo)儀（InfinitM200 PRO，TECAN，瑞士）檢測(cè)光密度［D（490 nm）］，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.2 熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將大鼠原代滑膜細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔微孔板中24 h，用不同質(zhì)量比值的復(fù)合物，包括OPEI/siRNA（最佳質(zhì)量比值為3∶1）和PEI25kDa/siRNA（最佳質(zhì)量比值為2∶1）處理4、24、40 和48 h；裸siRNA 作為對(duì)照。在微孔板中加入PrestoBlue 試劑（Invitrogen，美國(guó)），37 ℃下孵育1 h，熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化，在激發(fā)波長(zhǎng)570 nm和發(fā)射波長(zhǎng)610 nm處記錄熒光。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及siRNA轉(zhuǎn)染效率

1.5.1 檢測(cè)細(xì)胞凋亡 大鼠原代滑膜細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度接種于12 孔板上，在含10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)24 h，用含有不同質(zhì)量比值的復(fù)合物 的Opti-MEM （31985062，Life Technologies，美國(guó)）代替培養(yǎng)液，分別為OPEI/siRNA（最佳質(zhì)量比值為3∶1）和PEI 25 kDa/siRNA（最佳質(zhì)量比值為2∶1）；裸siRNA 作為對(duì)照。細(xì)胞孵育4 h，收獲后用1×PBS 洗滌。使用凋亡分析試劑盒（V13241，Life Technologies，美國(guó)）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。采用FlowJo流式細(xì)胞儀分析軟件（Tree Star，美國(guó)）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.5.2 檢測(cè)siRNA 轉(zhuǎn)染效率 OPEI（質(zhì)量比值為3∶1） 或PEI25kDa（質(zhì)量比值為2∶1） 轉(zhuǎn)染siRNA（FITC標(biāo)記）至大鼠原代滑膜細(xì)胞后，采用FlowJo流式細(xì)胞儀分析軟件（Tree Star，美國(guó)）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，比較2組的轉(zhuǎn)染效率。

1.6 激光共聚焦及熒光顯微鏡觀察體內(nèi)外滑膜細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效率

用Cy3 熒光素標(biāo)記的siRNA （GenePharma，中國(guó)）制備不同的復(fù)合物。將大鼠原代滑膜細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度種于12 孔板，培養(yǎng)24 h 后用不同復(fù)合物（OPEI/siRNA-Cy3 和PEI25kDa/siRNA-Cy3）以及裸siRNA-Cy3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h，用Hoechst 33342 和LysotrackerTMDND-99（Invitgen，美國(guó)） 分別標(biāo)記細(xì)胞核和溶酶體，用激光共聚焦顯微鏡（Cell Watch，ZEISS，德國(guó)）體外觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。在2 月齡大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射OPEI/siRNA-Cy3 和PEI25kDa/siRNA-Cy3，3 d 和7 d 后處死大鼠，收集滑膜，用熒光顯微鏡（Nikon，日本）觀察復(fù)合物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織化學(xué)法及Western blotting檢測(cè)

1.7.1 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)TRAF6基因 用PBS 洗滌細(xì)胞后，用TriPure 分離劑（93956520，羅氏公司，瑞士）從細(xì)胞中提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix cDNA 合成試劑盒（RR036A-1，Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄RNA樣品（1μg），獲得第一鏈cDNA。使用SYBR PreMix Ex TaqTM（RR420a，Takara，日本）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，使用LightCycler 480系統(tǒng)（羅氏公司，瑞士）測(cè)量TRAF6基因的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參。所用基因引物的序列如下。TRAF6-F：5′-AGAGGAATCACTTGCACG-3′；TRAF6-R： 5′-TCTGCGTTTCCATTTTTGGCG-3′。GAPDH-F： 5′-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3′；GAPDH-R：5′-CTTCCCATTTCTCAGCCG-3′。

1.7.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRAF6 表達(dá) 于內(nèi)側(cè)半月板切除后3 個(gè)月采集軟骨和滑膜標(biāo)本，固定脫鈣、石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRAF6表達(dá)。

1.7.3 Western blotting 檢測(cè) 細(xì)胞在裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 值7.4，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%Nonidet P-40，1 mmol/L PMSF，蛋白酶抑制劑） 中冰凍30 min。蛋白質(zhì)組分在4 ℃下15 000×g離心10 min，經(jīng)過(guò)10%的SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移膜用5%牛血清白蛋白封閉，加入特異性抗體，在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce，美國(guó)），在添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二級(jí)抗體后對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視 化。 抗TRAF6（ab40675）、 MMP13（ab39012，Abcam）由Abcam 公 司（英 國(guó)） 提 供， 抗p65（8242S）、p-p65（3033S）、cleaved caspase 3（9664s）、caspase 3（9665S）和GAPDH（2118）由Cell Signaling Technology公司（美國(guó)）提供。

1.8 BMSCs 成軟骨分化的阿爾新藍(lán)染色及細(xì)胞凋亡檢測(cè)

原代大鼠滑膜細(xì)胞與IL-1β 孵育24 h 后，分別用OPEI/siNC 和OPEI/siTRAF6 處理4 h，取上清液與BMSCs 軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液混合，誘導(dǎo)分化10 d。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定1 h，PBS 洗滌3 次，乙醇脫水，二甲苯洗滌，石蠟包埋、切片（5 μm）、載片。將切片脫蠟處理，并在室溫下用0.1%的阿爾新藍(lán)（Sigma-Aldrich，美國(guó)）原液孵育30 min。去除染料溶液，用蒸餾水輕輕清洗載玻片，用倒置顯微鏡（Eclipse TS100，尼康，日本） 觀察軟骨阿爾新藍(lán)染色結(jié)果。同時(shí)采用Western blotting 檢測(cè)IL-1β 刺激條件下，BMSCs 的cleaved caspase 3 表達(dá)水平，以及分別轉(zhuǎn)染OPEI/siNC 和OPEI/siTRAF6 后，IL-1β 刺激下BMSCs的cleaved caspase 3表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠OA 模型及原代滑膜細(xì)胞中TRAF6 的表達(dá)

術(shù)后3個(gè)月，免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示OA組關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中TRAF6的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（圖1A）。Western blotting結(jié)果顯示，在IL-1β刺激下，原代滑膜細(xì)胞中TRAF6、MMP13、TRAF6、p-p65的表達(dá)水平顯著升高；與對(duì)照組（Lipo2000/siNC）相比，實(shí)驗(yàn)組（Lipo2000/siTRAF6）上述蛋白的表達(dá)水平隨著TRAF6的沉默而顯著降低（圖1B～F）。

圖1 大鼠OA模型及IL-1β刺激下原代滑膜細(xì)胞中TRAF6的表達(dá)Fig 1 Expression of TRAF6 in OA models and IL-1β-stimulated primary synovial cells

2.2 OPEI/siRNA復(fù)合物的表征

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果證實(shí)質(zhì)量比值≥2，OPEI 完全包裹siRNA（圖2A）。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量形成的納米顆粒的尺寸，當(dāng)質(zhì)量比值從2 增大至10 時(shí)，OPEI表現(xiàn)出從23 mV 到43 mV 的可變Zeta 電位（圖2B）。不同質(zhì)量比值的OPEI/siRNA 復(fù)合物的粒徑見圖2C，與OPEI/siRNA 復(fù)合物形態(tài)的透射電子顯微鏡分析結(jié)果一致（圖2D～E）。

圖2 OPEI/siRNA復(fù)合物的表征Fig 2 Characterization of OPEI/siRNA polyplex

2.3 OPEI/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性

在2～50 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，與大鼠原代滑膜細(xì)胞孵育4 h 后，OPEI 聚合物的細(xì)胞存活率高于PEI25kDa（圖3A）。在質(zhì)量比值為2∶1～7∶1 時(shí)，OPEI/siRNA 復(fù)合物的細(xì)胞存活率為83.54%～93.07%，而對(duì)照組PEI25kDa/siRNA 復(fù)合物的細(xì)胞存活率為42.52%～87.26%（圖3B）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4、24、40、48 h 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示siRNA 對(duì)照組、OPEI 組、PEI25kDa 組細(xì)胞數(shù)均呈時(shí)間依賴性增加，但PEI25kDa組細(xì)胞增殖低于OPEI組和siRNA 對(duì)照組（P＜0.05），見圖3C。大鼠原代滑膜細(xì)胞與復(fù)合物孵育4 h 后的細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，與PEI25kDa/siRNA 組（活細(xì)胞百分率為88.54%）相比，OPEI/siRNA 組（活細(xì)胞百分率93.5%）細(xì)胞凋亡減少（圖3D），復(fù)合物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在轉(zhuǎn)染后4 h的早期階段（圖3E～H）。

圖3 OPEI和OPEI/siRNA復(fù)合物對(duì)大鼠原代滑膜細(xì)胞的生物相容性和細(xì)胞毒性Fig 3 Biocompatibility and cytotoxicity of OPEI and OPEI/siRNA polyplexes on rat primary synoviocytes

2.4 體外和體內(nèi)OPEI/siRNA 復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

OPEI（質(zhì)量比值為3∶1）或PEI（質(zhì)量比值為2∶1）轉(zhuǎn)染siRNA到大鼠原代滑膜細(xì)胞后，比較2組的轉(zhuǎn)染效率（圖4A）。在OPEI/FITC-siRNA 組的最佳質(zhì)量比值為3∶1 和PEI25kDa/FITC-siRNA 組的最佳質(zhì)量比值為2∶1 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別為99.33%和97.17%。OPEI/siRNA （最佳質(zhì)量比值為3∶1） 和PEI25kDa/siRNA（最佳質(zhì)量比值為2∶1）與大鼠原代滑膜細(xì)胞孵育1 h 后，用共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染狀況（圖4B）。溶酶體用LysotrackerTM DND-99（紅色）標(biāo)記，siRNA用FAM（綠色）標(biāo)記，細(xì)胞核用藍(lán)色標(biāo)記。結(jié)果表明，體外OPEI/FAM-siRNA 和PEI25 kDa/FAMsiRNA 均顯示大量細(xì)胞攝取siRNA。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，OPEI/Cy3-siRNA和PEI25 kDa/Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠滑膜在第3 日、第7 日均顯示出高水平的siRNA轉(zhuǎn)染效率（紅色，圖4C），而陰性對(duì)照（裸siRNA）組滑膜組織中未觀察到siRNA（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖4 OPEI/siRNA復(fù)合物在體外和體內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Fig 4 Cell transfection efficiency of OPEI/siRNA polyplexs in vitro and in vivo

2.5 OPEI/siTRAF6 復(fù)合物對(duì)大鼠原代滑膜細(xì)胞TRAF6基因敲除效率

不同的質(zhì)量比值的OPEI/siTRAF6 或PEI25kDa/siRNA 復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠原代滑膜細(xì)胞2 d 后，熒光定量PCR結(jié)果顯示：與裸siTRAF6對(duì)照組（NC）相比，OPEI/siTRAF6 組在質(zhì)量比值為3∶1、4∶1 和5∶1 時(shí)，TRAF6沉默的比例分別為58.1%、41.62%和60%；PEI25kDa/siTRAF6 組在質(zhì)量比值為2∶1 時(shí)，TRAF6沉默的比例為61.38%（圖5A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，OPEI/siRNA 復(fù)合物（最佳質(zhì)量比值為3∶1） 在 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 后5、7 和10 d 穩(wěn) 定 沉 默TRAF6，PEI25kDa/siRNA 復(fù)合物（最佳質(zhì)量比值為2∶1）在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后5、7 d 沉默TRAF6（圖5B）。Western blotting 檢測(cè)不同質(zhì)量比值的復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞2 d 后TRAF6 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示OPEI/siTRAF6 組在質(zhì)量比值為3∶1、4∶1 和5∶1 時(shí)，TRAF6基因敲除效率分別為49.05%、74.61%和83.18%（圖5C～D）。

圖5 OPEI/siTRAF6復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠原代滑膜細(xì)胞的TRAF6基因敲除效率Fig 5 TRAF6 knockdown efficiency of OPEI/siTRAF6 polyplexes in rat primary synoviocytes

2.6 OPEI/siTRAF6 沉 默TRAF6 基 因 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠原代滑膜細(xì)胞炎癥的抑制作用

將大鼠原代滑膜細(xì)胞與IL-1β 共孵育48 h，并以不同質(zhì)量比值的復(fù)合物轉(zhuǎn)染4 h 后，Western blotting分析結(jié)果顯示：與裸siTRAF6 對(duì)照組相比，OPEI/siTRAF6 組（質(zhì)量比值為3∶1 和4∶1）和PEI25kDa/siTRAF6組（質(zhì)量比值為2∶1和2.5∶1）均可明顯抑制TRAF6表達(dá)（圖6A、B）。OPEI/siTRAF6組（質(zhì)量比值為2∶1、3∶1 和4∶1）比PEI25kDa/siTRAF6 組（質(zhì)量比值為2∶1、2.5∶1）能更有效地降低p-p65 的表達(dá)（圖6C、D）。

圖6 TRAF6基因敲除對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞炎癥的影響Fig 6 Effect of TRAF6 knockdown on IL-1β-induced inflammation in rat primary synoviocytes

2.7 TRAF6 基因敲除對(duì)BMSCs 軟骨形成能力的恢復(fù)作用

與未刺激組相比，IL-1β刺激條件下BMSCs的軟骨形成能力明顯下降；但經(jīng)OPEI/siTRAF6 處理后，與OPEI/siNC 對(duì)照相比，阿爾新蘭染色顯示BMSCs的軟骨形成能力明顯恢復(fù)（圖7A）。Western blotting結(jié)果顯示：與對(duì)照組（Naked siNC）相比，IL-1β 刺激條件下，BMSCs 的cleaved caspase 3 表達(dá)明顯升高（圖7B）。定量分析結(jié)果顯示，IL-1β+OPEI/siTRAF6組cleaved caspase 3 的表達(dá)低于IL-1β+OPEI/siNC 組（圖7C）。caspase 3 在各組中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖7D）。該結(jié)果提示TRAF6基因敲除可挽救IL-1β誘導(dǎo)的炎癥條件下BMSCs 的成軟骨分化及抑制BMSCs凋亡。

3 討論

OA 的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。與趨化因子和促炎細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的炎癥是關(guān)節(jié)炎發(fā)病的原因之一。在多種致炎細(xì)胞因子中，TNF-α、IL-6 和IL-1β 在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。IL-1、IL-6、IL-17 和TNF-α的異常水平刺激NF-κB激活，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞［28-30］。研究表明，泛素連接酶TRAF6在天然免疫、促炎細(xì)胞因子和抗原受體與典型的NF-κB 途徑之間起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［31］。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到TRAF6在大鼠OA模型滑膜和軟骨中均有過(guò)表達(dá)，提示TRAF6可能在OA的病理過(guò)程中起重要作用。進(jìn)一步用siRNA 敲除TRAF6，發(fā)現(xiàn)可明顯降低IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠原代滑膜細(xì)胞炎癥模型中MMP13 和p-p65 的表達(dá)，提示抑制TRAF6 活性是治療OA的一種很有前景的新策略。

臨床siRNA的治療面臨的主要挑戰(zhàn)之一是缺乏有效和安全的優(yōu)化遞送載體［32-33］。商業(yè)上可獲得的PEI25kDa 是一種經(jīng)典的基因遞送載體，但缺乏可生物降解的化學(xué)鍵（C-C 或C-N 鍵），且毒性太高，不適合臨床使用。為了優(yōu)化siRNA向關(guān)節(jié)的轉(zhuǎn)移，我們合成了一種小分子交聯(lián)聚乙烯亞胺（OPEI）。利用鄰苯二甲醛的醛基與PEI1.8K 的氨基反應(yīng)生成可降解的亞胺鍵（-N=C-）。結(jié)果表明，OPEI/siRNA 在大鼠原代滑膜細(xì)胞中具有與PEI25kDa/siRNA 相似的轉(zhuǎn)染效率，但細(xì)胞毒性明顯低于PEI25kDa/siRNA，OPEI 組的細(xì)胞凋亡率低于PEI25kDa 組。細(xì)胞存活率的提高可能是OPEI/siRNA組與PEI25kDa/siRNA組相比可更穩(wěn)定地抑制TRAF6 的原因［34］。體內(nèi)觀察結(jié)果顯示OPEI/Cy3-siRNA 轉(zhuǎn)染后3、7 d，滑膜細(xì)胞Cy3-siRNA 高表達(dá)。這些結(jié)果表明，OPEI 可作為一種高效、低毒siRNA體內(nèi)外輸送載體。

炎癥因子的級(jí)聯(lián)作用可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，因此，抑制炎癥因子的表達(dá)已成為治療OA的重要策略。然而，目前的研究表明，生物制劑可以延緩惡化的進(jìn)程，但不能促進(jìn)組織修復(fù)［4］。與迄今大多數(shù)直接抑制IL-1β 和TNF-α 的研究不同［8-9，35］，我們的研究表明，通過(guò)siRNA靶向IL-1β的下游可能會(huì)產(chǎn)生更好的結(jié)果。大多數(shù)關(guān)節(jié)炎病例與創(chuàng)傷無(wú)關(guān)，有多種潛在的主要原因，包括遺傳傾向、衰老、生物力學(xué)改變、肥胖或全身炎癥狀況［36］。目前關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但慢性細(xì)胞因子暴露、信號(hào)異常和體細(xì)胞突變等可能參與了病理過(guò)程［37］。本研究中，將TRAF6siRNA 轉(zhuǎn)染大鼠原代滑膜細(xì)胞來(lái)抑制TRAF6 表達(dá)，一方面抑制IL-1/MMP13/p65 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，另一方面減少BMSCs 凋亡，并顯著激發(fā)由IL-1β誘導(dǎo)的炎癥抑制的BMSCs的軟骨形成能力。與現(xiàn)有的治療方法相比，這代表著生理和功能上的結(jié)果都有所改善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TRAF6在大鼠OA模型滑膜和軟骨中過(guò)表達(dá)。我們進(jìn)一步合成了一種低毒、可生物降解的小分子PEI（OPEI），將siTRAF6 轉(zhuǎn)染到TRAF6基因上。結(jié)果顯示，抑制TRAF6 不僅可以對(duì)抗IL-1/MMP13/p65 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，還可以減少BMSCs的凋亡，并顯著增強(qiáng)IL-1β誘導(dǎo)的炎癥抑制的BMSCs 的軟骨形成能力，提示TRAF6 可能是OA 治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：XHEC-F-NSFC-2018-275）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照上海交通大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)的程序和原則進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No.XHEC-F-NSFC-2018-275，dated 01/03/2018），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines and principles approved by the Animal Protection Committee of Shanghai Jiao Tong University.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

劉宏強(qiáng)、張曉玲參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；劉宏強(qiáng)、陸艷青、高宇軒參與了論文的寫作和修改；王一云、王傳東參與了數(shù)據(jù)分析。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Hongqiang and ZHANG Xiaoling.The manuscript was drafted and revised by LIU Hongqiang， LU Yanqing and GAO Yuxuan. The data was analyzed by WANG Yiyun and WANG Chuandong. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-06

·Accepted：2022-06-18

·Published online：2022-07-28