李昕雨，左 斌，王 文，鈕曉音，翁 震，何 楊

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，蘇州 215123；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種以不明原因的血小板減少（外周血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L）為特征的自身免疫性疾病。ITP 患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為出血趨勢(shì)的增加，如皮膚、黏膜的自發(fā)性出血等，嚴(yán)重者可發(fā)生危及生命的內(nèi)臟及顱內(nèi)出血［1］。因此，有必要探索ITP的病理生理機(jī)制以改進(jìn)ITP的臨床治療方法。

血小板生成減少是ITP主要的致病機(jī)制［2］。血小板生成是發(fā)生在骨髓微環(huán)境中的一系列連續(xù)、復(fù)雜的過(guò)程，主要包括巨核細(xì)胞的分化、成熟及血小板釋放3 個(gè)階段，該過(guò)程中任一階段的異常均有可能導(dǎo)致血小板生成的異常［3］。骨髓脂肪細(xì)胞是骨髓微環(huán)境中最豐富的細(xì)胞。研究［4］發(fā)現(xiàn)，骨髓脂肪細(xì)胞能夠通過(guò)分泌脂聯(lián)素、瘦素、白介素-6等脂肪細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的增殖和分化。

脂聯(lián)素基因是脂肪組織中表達(dá)最豐富的基因，它主要參與糖、脂和骨代謝調(diào)控，近來(lái)發(fā)現(xiàn)其還具有抗糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥等多種作用。脂聯(lián)素主要通過(guò)脂聯(lián)素受體（ADIPOR1、ADIPOR2）發(fā)揮作用［5］。已有研究［6］表明小鼠HSC 表達(dá)ADIPOR1、ADIPOR2，2 種受體能夠通過(guò)激活p38 絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）促進(jìn)HSC 的增殖并使細(xì)胞保持在不成熟的狀態(tài)。但目前尚不清楚脂聯(lián)素是否參與了血小板生成的調(diào)控。

因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)ITP 患者血漿脂聯(lián)素水平，從臨床角度初步探討脂聯(lián)素與ITP 的相關(guān)性；并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究脂聯(lián)素及其受體在巨核細(xì)胞分化、成熟中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素雙抗混合液均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司， TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，HiScript ⅢAll-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 試劑盒均購(gòu)自南京Vazyme 公司，人脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，ADIPOR1 多克隆兔抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，ADIPOR2 多克隆兔抗體、脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑AdipoRon 均購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司，PE 小鼠抗人CD41a 抗體、FITC 小鼠抗人CD41a 抗體均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司，豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、Hoechst 33342 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP 羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

StepOnePlus ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，UVP ChemStudio SA2 多功能凝膠成像儀購(gòu)自德國(guó)Analytikjena 公司，Gallios 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 臨床資料

2021 年1 月 至2022 年2 月，共 有46 例ITP 患 者及30 名健康對(duì)照者被納入研究。ITP 患者來(lái)源于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，健康對(duì)照（HC）組來(lái)源于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院保健體檢中心。ITP 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床確診ITP，其診斷均基于美國(guó)血液學(xué)會(huì)2019 版ITP 指南［7］及《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)指南（2020 年版）》［8］；收集外周血標(biāo)本前1 個(gè)月未接受任何ITP 相關(guān)治療。ITP 患者排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他導(dǎo)致血小板減少的原因。HC 組納入標(biāo)準(zhǔn)：均為健康志愿者，其年齡、性別及BMI 與ITP 患者相匹配，外周血小板計(jì)數(shù)正常。此外，根據(jù)ITP 患者臨床病程的不同，將ITP 患者進(jìn)一步分為新診斷ITP（診斷＜3個(gè)月）、持續(xù)性ITP（3～12個(gè)月）和慢性ITP（＞12個(gè)月）3個(gè)臨床亞組。

1.3 標(biāo)本制備

取ITP 患者以及HC 組外周血置于EDTA-K2抗凝管中，1 300×g離心10 min，即獲得EDTA-K2抗凝血漿，并于-80 ℃凍存。

1.4 血漿脂聯(lián)素水平的測(cè)定

ITP 患者及HC 組血漿脂聯(lián)素水平使用人脂聯(lián)素ELISA試劑盒檢測(cè)，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

人髓系白血病細(xì)胞株K562、人巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞株MEG-01 及Dami、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 均由蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心保存。所有細(xì)胞相關(guān)操作均于超凈臺(tái)中進(jìn)行。MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基；K562、MEG-01 及Dami 細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的RPMI 1640 培養(yǎng)基。所有細(xì)胞于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 Western blotting 檢測(cè)脂聯(lián)素受體在蛋白水平上的表達(dá)

取一定數(shù)量（一般不低于1×106個(gè)細(xì)胞）且正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)洗滌后，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。然后行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。隨后按照抗體說(shuō)明書(shū)的推薦濃度進(jìn)行ADIPOR1或ADIPOR2相應(yīng)一抗的孵育，4 ℃孵育過(guò)夜。使用PBST 洗膜后，加入相應(yīng)HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h 后進(jìn)行洗膜、顯影。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)脂聯(lián)素受體在mRNA水平上的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）需要取一定數(shù)量（一般不低于1×106個(gè)細(xì)胞）且正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)洗滌后，使用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，然后以合成的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線階段為95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物（5'→3'）Tab 1 Primer sequences for RT-qPCR（5'→3'）

1.8 細(xì)胞系分化、成熟模型的建立

1.8.1 K562 細(xì)胞分化模型 人髓系細(xì)胞株K562 在PMA 的刺激下，能夠向巨核細(xì)胞系分化［9-11］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用10 ng/mL 的PMA 刺激K562 細(xì)胞，于72 h后使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估其分化情況。

1.8.2 MEG-01、Dami 細(xì)胞成熟模型 人巨核細(xì)胞系細(xì)胞株MEG-01、Dami 在PMA 的刺激下，能夠進(jìn)一步成熟［12-15］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用10 ng/mL 的PMA 刺激MEG-01、Dami 細(xì)胞，于72 h 后使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估其成熟情況。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞系的分化

收集需要檢測(cè)的各組細(xì)胞分別置于15 mL離心管中，300×g離心5 min，棄上清液。使用100 μL PBS重懸細(xì)胞，每管加入PE-CD41a 抗體5 μL，室溫避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，每管加入1 mL PBS 進(jìn)行洗滌，于300×g離心5 min，棄上清液。隨后，每孔加入300～400 μL PBS 重懸，上機(jī)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)CD41+細(xì)胞百分比以評(píng)估細(xì)胞分化情況。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞系的成熟

收集需要檢測(cè)的各組細(xì)胞分別置于15 mL離心管中，300×g離心5 min，棄上清液。使用100 μL 含有DNA 染料Hoechst 33342（10 μg/mL）的PBS 重懸細(xì)胞，每管加入FITC-CD41a 流式抗體5 μL，室溫避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，每管加入1 mL PBS 進(jìn)行洗滌，于300×g離心5 min，棄上清液。隨后，每孔加入300～400 μL PBS 重懸，上機(jī)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)CD41+細(xì)胞百分比、CD41 表達(dá)量即平均熒光強(qiáng)度（mean fluoresence intensity，MFI）、多倍體細(xì)胞（≥4N）百分比3個(gè)指標(biāo)以評(píng)估細(xì)胞成熟情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用D′Agostino-Pearson 正態(tài)性檢驗(yàn)對(duì)ITP 患者、HC 組及各亞組的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，由于各組數(shù)據(jù)均不滿(mǎn)足 正 態(tài) 分 布， 故 數(shù) 據(jù) 采 用M（Q1，Q3） 或M（Min～Max）表示，并使用Mann-Whitney 檢驗(yàn)比較ITP 患者和HC 組之間、各亞組之間血漿脂聯(lián)素水平的差異。Spearman 相關(guān)性分析用于確定血漿脂聯(lián)素水平與ITP 患者體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）之間的相關(guān)性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分使用Student′st檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均來(lái)自3 次及以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者和HC組的臨床特征

參與本項(xiàng)研究的ITP 患者以及HC 組的臨床特征如表2所示。共有46例ITP患者和30名年齡、性別與ITP 患者相匹配的健康對(duì)照者被納入統(tǒng)計(jì)。ITP 患者與HC 組的血小板計(jì)數(shù)中位數(shù)分別為32.0×109/L 和220.5×109/L（P=0.000），其他一般特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 ITP患者及HC組的臨床資料Tab 2 Clinical information of ITP patients and healthy controls

2.2 ITP患者和HC組血漿脂聯(lián)素水平

46 例ITP 患者及30 名健康對(duì)照者的血漿脂聯(lián)素水平如圖1所示。與HC組相比，ITP患者血漿中脂聯(lián)素水平顯著升高（P=0.000）。

圖1 ITP患者和HC組血漿脂聯(lián)素水平Fig 1 Plasma adiponectin levels in the ITP patients and the healthy controls

既往研究［16］發(fā)現(xiàn)，血漿脂聯(lián)素水平與被檢者BMI呈負(fù)相關(guān)。為了確定ITP患者血漿脂聯(lián)素水平的升高是否與患者BMI相關(guān)，我們對(duì)ITP患者的血漿脂聯(lián)素水平與其BMI進(jìn)行相關(guān)性分析，并根據(jù)中國(guó)BMI參考標(biāo)準(zhǔn)將ITP患者分為BMI＜24 kg/m2（n=23）和BMI≥24 kg/m2（n=23）2個(gè)亞組比較血漿脂聯(lián)素水平的差異。結(jié)果如圖2所示：ITP患者的血漿脂聯(lián)素水平與BMI之間無(wú)相關(guān)性（P=0.621），且2個(gè)BMI亞組的ITP患者的 血漿脂聯(lián)素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.295）。

圖2 ITP患者血漿脂聯(lián)素水平與BMI之間的關(guān)系Fig 2 Relationship between plasma adiponectin level and BMI in the patients with ITP

2.3 不同病程的ITP患者血漿脂聯(lián)素水平

結(jié)果如圖3 示：與HC 組相比，3 種不同病程的ITP 患者，即新診斷ITP 患者（P=0.001）、持續(xù)性ITP 患者（P=0.003） 及慢性ITP 患者（P=0.001），其血漿脂聯(lián)素水平均呈現(xiàn)不同程度的升高。但不同病程的ITP 患者之間的血漿脂聯(lián)素水平并無(wú)明顯差異。

圖3 不同病程的ITP患者血漿脂聯(lián)素水平Fig 3 Plasma adiponectin levels in the ITP patients with different courses of disease

2.4 ADIPOR1、ADIPOR2 在K562、MEG-01、Dami細(xì)胞株中的表達(dá)

脂聯(lián)素主要通過(guò)其受體ADIPOR1和ADIPOR2發(fā)揮作用。因此，為明確脂聯(lián)素在巨核細(xì)胞分化、成熟中的作用，必須首先確定脂聯(lián)素受體在相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)。

我們利用RT-qPCR、Western blotting 技術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平上研究脂聯(lián)素受體在髓系細(xì)胞株K562，巨核細(xì)胞系細(xì)胞株MEG-01、Dami 中的表達(dá)，并選用乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 作為ADIPOR1、ADIPOR2 表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照［17］。結(jié)果如圖4 所示：K562、MEG-01 及Dami 細(xì)胞在mRNA 水平及蛋白水平均表達(dá)ADIPOR1、ADIPOR2。

圖4 脂聯(lián)素受體在K562、MEG-01、Dami細(xì)胞株中的表達(dá)(n=4)Fig 4 Expression of adiponectin receptors in the cell lines K562,MEG-01 and Dami(n=4)

2.5 脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)髓系細(xì)胞株K562分化的影響

將不同濃度的AdipoRon（1、10 及20 μmol/L）與PMA 共同培養(yǎng)K562 細(xì)胞，對(duì)照組為PMA+DMSO組。培養(yǎng)72 h后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD41+細(xì)胞百分比。結(jié)果如圖5所示：較PMA+DMSO 組，10μmol/L和20μmol/L AdipoRon 處理組的CD41+細(xì)胞百分比顯著降低（均P=0.000）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)K562細(xì)胞株分化的影響(n=4)Fig 5 Effect of AdipoRon on the differentiation of the cell line K562 detected by flow cytometry(n=4)

2.6 脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)巨核細(xì)胞系細(xì)胞株MEG-01和Dami成熟的影響

將不同濃度的AdipoRon（1、10 及20 μmol/L）與PMA 共同培養(yǎng)MEG-01、Dami 細(xì)胞，對(duì)照組為PMA+DMSO 組。培養(yǎng)72 h 后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞成熟相關(guān)指標(biāo)，即CD41+細(xì)胞百分比、CD41 表達(dá)量（CD41-MFI）、 多 倍 體（≥4N） 細(xì) 胞 比 例。MEG-01 細(xì)胞株結(jié)果如圖6 所示：與PMA 對(duì)照組相比，20 μmol/L AdipoRon 處理組的CD41 表達(dá)量（P=0.047）與多倍體細(xì)胞比例（P=0.003）均出現(xiàn)顯著增加。在Dami細(xì)胞株上，各濃度AdipoRon處理組的細(xì)胞CD41 表達(dá)量以及多倍體細(xì)胞比例較對(duì)照組均未顯著增加（圖7）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)MEG-01細(xì)胞株成熟的影響(n=3)Fig 6 Effect of AdipoRon on maturation of the cell line MEG-01 detected by flow cytometry(n=3)

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)Dami細(xì)胞株成熟的影響(n=3)Fig 7 Effect of AdipoRon on maturation of the cell line Dami detected by flow cytometry(n=3)

3 討論

ITP 是發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的一種自身免疫性疾病，患者體內(nèi)產(chǎn)生的包括抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）和抗血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ（platelet glycoprotein Ⅰb/Ⅸ，GPⅠb/Ⅸ）在內(nèi)的病理性血小板自身抗體是發(fā)生血小板破壞的重要原因［2］。但值得注意的是，在ITP的實(shí)驗(yàn)診斷研究［18-20］中，血小板自身抗體（GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ）檢出率僅為50%～70%。此外，研究［21-22］發(fā)現(xiàn)，TPO 并不是血小板生成這一過(guò)程中唯一的調(diào)控因子。因此，推測(cè)存在其他因素共同參與了ITP的發(fā)生。

近年來(lái)，有研究［4］報(bào)道：脂聯(lián)素、瘦素等多種脂肪細(xì)胞因子與骨髓造血穩(wěn)態(tài)的維持、某些血液疾病的發(fā)生等息息相關(guān)。在本研究中，我們通過(guò)檢測(cè)ITP患者血漿脂聯(lián)素水平，從臨床角度初步探討了脂聯(lián)素與ITP 的相關(guān)性，為后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)提供了臨床基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同病程的ITP 患者血漿脂聯(lián)素水平均顯著高于HC 組。另外，既往研究對(duì)被檢者的脂聯(lián)素水平與其BMI 的相關(guān)性進(jìn)行了報(bào)道。NIELSEN等［16］發(fā)現(xiàn)：被檢者的血漿脂聯(lián)素水平與其BMI呈負(fù)相關(guān)，這種相關(guān)性未針對(duì)特定人群。而KUO 等［23］發(fā)現(xiàn)：對(duì)健康成人進(jìn)行的研究并不支持BMI 影響脂聯(lián)素血漿水平的報(bào)道；研究人員考慮已報(bào)道的與肥胖相關(guān)的包括脂聯(lián)素在內(nèi)的血漿脂肪因子水平變化可能是肥胖相關(guān)代謝紊亂的結(jié)果。因此，為排除ITP 患者升高的血漿脂聯(lián)素水平可能受其BMI 的影響，我們對(duì)兩者進(jìn)行了相關(guān)性分析，并對(duì)BMI＜24 kg/m2和BMI≥24 kg/m22 個(gè)亞組的ITP 患者血漿脂聯(lián)素水平進(jìn)行比較。結(jié)果均表明ITP 患者血漿脂聯(lián)素水平的升高與BMI變化無(wú)關(guān)。另一方面，本研究中選取的HC 組的BMI 與ITP 組相比無(wú)明顯差異。據(jù)此，我們認(rèn)為ITP患者血漿脂聯(lián)素水平較HC組的升高是由ITP疾病本身引起的。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們確定了人髓系細(xì)胞株K562、巨核細(xì)胞系細(xì)胞株MEG-01 及Dami 均表達(dá)脂聯(lián)素受體ADIPOR1 和ADIPOR2；并發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑能夠抑制巨核細(xì)胞的分化。CHANG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)：將ITP 患者的血漿加入巨核細(xì)胞體外分化體系后，體外培養(yǎng)得到的巨核細(xì)胞數(shù)量減少，且是由病理性的血小板自身抗GPⅠb、抗GPⅡb/Ⅲa抗體所致。在K562細(xì)胞株的分化模型中，高濃度脂聯(lián)素激動(dòng)劑（10、20 μmol/L AdipoRon）處理組的CD41+細(xì)胞比例顯著下降，故推測(cè)脂聯(lián)素能夠抑制髓系細(xì)胞向巨核細(xì)胞系分化。雖然ITP 患者的血漿脂聯(lián)素水平增高可能引起巨核細(xì)胞數(shù)量的減少，從而解釋ITP 患者血小板生成的減少，但在臨床上，僅有少部分ITP 患者會(huì)出現(xiàn)巨核細(xì)胞數(shù)量的減少，大多數(shù)患者的巨核細(xì)胞數(shù)量正?；虺试黾于厔?shì)。

MCMILLAN等［25］發(fā)現(xiàn)ITP患者血漿不僅能使體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞數(shù)量減少，而且能夠抑制巨核細(xì)胞成熟，即導(dǎo)致4N、8N 和16N 細(xì)胞減少。此外，YANG 等［26］觀察到大多數(shù)ITP 患者的血漿能夠增加巨核細(xì)胞的生成但使巨核細(xì)胞出現(xiàn)成熟障礙，即多倍體細(xì)胞顯著減少。在巨核細(xì)胞MEG-01 成熟模型中，我們發(fā)現(xiàn)20 μmol/L AdipoRon 對(duì)巨核細(xì)胞株MEG-01多倍體化具有促進(jìn)作用，但在Dami 細(xì)胞株中未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。故尚不能確定脂聯(lián)素對(duì)巨核細(xì)胞成熟的影響。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ITP 患者血漿脂聯(lián)素水平升高，髓系、巨核細(xì)胞系細(xì)胞株上表達(dá)脂聯(lián)素受體，且脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)巨核細(xì)胞分化具有抑制作用。值得注意的是，巨核細(xì)胞的多倍體化是巨核細(xì)胞成熟的重要表現(xiàn)；在臨床上，多數(shù)ITP 患者的巨核細(xì)胞有成熟障礙的表現(xiàn)。但本研究反而在一個(gè)巨核細(xì)胞株上觀察到脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑對(duì)多倍體化的促進(jìn)作用。后續(xù)，我們將建立人造血干細(xì)胞體外分化巨核細(xì)胞模型，系統(tǒng)研究脂聯(lián)素對(duì)巨核細(xì)胞分化、成熟及血小板生成過(guò)程的影響。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)［文件號(hào)2020倫審（申報(bào)）批第452號(hào)］。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照世界醫(yī)學(xué)會(huì)的《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬均簽署知情同意書(shū)。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Medical Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University （Approval Letter No. 2020-452），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofHelsinki Declarationof the World Medical Association.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

李昕雨、左斌、何楊、鈕曉音參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；李昕雨、左斌、王文參與了實(shí)驗(yàn)操作；李昕雨、左斌、何楊、翁震、鈕曉音參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LI Xinyu，ZUO Bin，HE Yang and NIU Xiaoyin.The study was operated by LI Xinyu，ZUO Bin and WANG Wen.The manuscript was drafted and revised by LI Xinyu，ZUO Bin，HE Yang，WENG Zhen and NIU Xiaoyin.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-24

·Accepted：2022-07-12

·Published online：2022-07-28