王雨心，孫瑞琪，劉堅華，何偉娜

上海交通大學基礎醫(yī)學院藥物化學與生物信息學中心，上海 200025

癌癥是全球性重大公共衛(wèi)生問題，大部分癌癥患者確診即晚期，可選治療方法有限且預后不佳，給個人、家庭和社會帶來了巨大的負擔［1-2］。因此，癌癥的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療至關重要［3］。腫瘤成像技術是癌癥診斷必不可少的工具。近年來，具備高時空分辨率和低生物毒性的熒光成像技術開始逐步應用于在體成像領域。尤其是發(fā)射波長位于700～1 000 nm的近紅外（near infrared，NIR）熒光成像技術，不但可以顯著避免生物組織自發(fā)熒光和光子散射的干擾，且具有優(yōu)越的組織穿透性，已成為腫瘤成像技術中的一大研究熱點［4-5］。

普通的熒光探針在體成像時始終保持熒光信號的發(fā)射，因此無法很好地將正常組織（如肝、腎等）與腫瘤組織區(qū)分開，易產(chǎn)生“假陽性”的結果。為了實現(xiàn)腫瘤組織的特異性成像，采用腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）響應性熒光探針［6］是一個很有效的策略。腫瘤組織由于異常增殖、血液灌注不足及代謝失調(diào)，微環(huán)境組分發(fā)生改變，表現(xiàn)出乳酸增加、葡萄糖濃度降低、酸性升高、乏氧和免疫細胞募集等特征［7-10］。針對腫瘤組織間質pH值為6.4～7.0，而正常組織間質pH值為7.3～7.4這一差異，設計pH響應性熒光探針，使其在酸性環(huán)境中顯示較強熒光，而在堿性環(huán)境中顯示較弱熒光，以實現(xiàn)腫瘤組織與正常組織的差別化成像，將極大地提高腫瘤成像的信噪比和精準度。

目前，pH響應性熒光探針的母核結構大多為熒光素［11］、羅丹明［12］、氟硼吡咯［13］、萘酰亞胺［14］和花菁［15］等。其中，僅有花菁母核的吸收及發(fā)射波長范圍位于NIR波段，在腫瘤成像研究領域備受關注［16-17］?；ㄝ碱悷晒馓结樃鶕?jù)其所響應的最佳pH范圍可分為2類：第一類探針響應于酸性-微酸性（pH＜7.0）環(huán)境［15，18-20］，而第二類探針響應于微酸性-中性（pH 6.4～7.4）環(huán)境［21-24］。其中，第二類探針對TME的響應更加靈敏，更適用于腫瘤成像。但是，已報道的微酸性-中性響應性花菁類探針普遍存在水溶性較差、缺少連接基團等問題。因此，開發(fā)具有連接基團、水溶性強、光學性能良好且pH響應范圍與TME相符的花菁類熒光探針具有重要的研究意義。本研究擬合成水溶性pH響應性花菁類近紅外熒光探針，并評估其光學性能，以期為該探針的腫瘤在體成像應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物

人宮頸癌細胞系HeLa、人結腸癌細胞系HCT-116 購自美國菌種保藏中心；6 周齡SPF 級BALB/c 雌性小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司。動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0001，使用許可證號SYXK（滬）2018-0031。

1.2 主要試劑和儀器

2-氯-3-（羥基亞甲基）-環(huán)己-1-烯甲醛（上海安米克化學品有限公司），1-（5-羧基己基）-2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸內(nèi)鹽、6-（2，3，3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基）乙酸溴化物（陜西金杰森茂生物科技有限公司），1-甲基哌嗪（TCI，日本），DMEM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司，美國），CCK-8試劑盒（Dojindo研究所，日本），Hoechst探針（上海碧云天生物技術有限公司）。

pH 計（Mettler Toledo 公司，瑞士），CombiFlash?Rf200分離純化制備色譜儀（Teledyne公司，美國），1260高效液相色譜儀（Agilent公司，美國），高分辨率質譜儀（AB SCIEX公司，美國），超高效液相色譜-四極桿質譜儀（Waters公司，美國），Avance Ⅲ400M核磁共振波譜儀（Bruker公司，德國），暗箱三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司），紫外-可見分光光度計（上海棱光技術有限公司），穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（Edinburgh公司，英國），EnSight多功能成像酶標儀（PerkinElmer公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國），Smart-LF 緊湊型小動物熒光&生物發(fā)光成像系統(tǒng)（Vieworks公司，韓國）。

1.3 探針合成與結構表征

1.3.1 合成路線 在MYOCHIN等［24］合成的熒光探針（化合物1）的基礎上，設計優(yōu)化合成路線（圖1）：在花菁類結構的兩端吲哚氮原子上引入末端羧基修飾的長碳鏈；同時在兩端吲哚芳環(huán)上引入磺酸基，構建探針R2S（化合物7）。此外，相對應的未引入磺酸基的探針R2Z（化合物8），作為對照也同時被合成。

圖1 探針R2S與R2Z的合成路線Fig 1 Synthetic routes of the target probes R2S and R2Z

1.3.2 化合物5的合成與純化 向10 mL 乙酸中加入化合物2 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸鈉（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光攪拌1 h。反應后，溶液由深棕色轉變?yōu)槟G色。冷卻后，加入乙醚，靜置待析出沉淀。棄去上清液后，加入超純水溶解粗產(chǎn)物，通過C18柱層析進行純化。用超純水/甲醇進行梯度洗脫，收集含目標產(chǎn)物的組分。減壓濃縮，冷凍干燥。

1.3.3 化合物6的合成與純化 向10 mL 乙酸中加入化合物3 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸鈉（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光攪拌1 h。反應后，溶液由深棕色轉變?yōu)槟G色。冷卻后，加入乙醚，靜置待析出沉淀。棄去上清液后，加入二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，通過硅膠柱層析進行純化。以二氯甲烷/甲醇（體積比20∶1）混合液為洗脫劑，收集含目標產(chǎn)物的組分，減壓濃縮，真空干燥。

1.3.4 R2S 的合成與純化 向10 mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）中加入化合物5（0.84 g，1.0 mmol）和1-甲 基 哌 嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氬氣保護下，避光攪拌4 h。反應后，溶液由墨綠色轉變?yōu)樯钏{色。冷卻后，減壓干燥，加入超純水溶解粗產(chǎn)物，通過C18柱層析進行純化。采用超純水/甲醇對色譜柱進行梯度洗脫，收集含目標產(chǎn)物的組分。減壓濃縮，冷凍干燥。

1.3.5 R2Z 的合成與純化 向10 mL DMF 中加入化合物6（0.68 g，1.0 mmol）和1-甲基哌嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氬氣保護下，避光攪拌4 h。反應后，溶液由墨綠色轉變?yōu)樯钏{色。冷卻后，減壓干燥，加入二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，通過硅膠柱層析進行純化。以二氯甲烷/甲醇（體積比20∶1）混合液為洗脫劑，收集含目標產(chǎn)物的組分，減壓濃縮，真空干燥。

1.3.6 化合物的結構表征 對于純化后獲得的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，均通過質譜（mass spectroscopy，MS） 確定相對分子質量，通過磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）鑒定結構，通過分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography， HPLC） 檢 測純度。

1.4 光譜學特性表征

取R2S、R2Z 分別溶于不同pH 值的磷酸鹽緩沖液（sodium phosphate buffer，PBS），用紫外-可見分光光度計進行吸收光譜檢測，穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀進行發(fā)射光譜檢測。

基于發(fā)射光譜，讀取探針R2S、R2Z 在質子化狀態(tài)下最大發(fā)射波長（λEmmax）處對應的熒光強度數(shù)值（Imax），及不同pH 條件下探針于相應λEmmax處的熒光強度I，計算相對熒光強度（I/Imax），繪制探針的相對熒光強度對pH 值的響應曲線。在曲線上讀取ΔI/Imax中值處對應的pH數(shù)值，即探針的酸解離常數(shù)（pKa）。

1.5 pH響應可逆性測試

取R2S、R2Z 分別溶于pH 3.68 的PBS，檢測其吸收光譜；隨后，滴加氫氧化鈉溶液，將待測溶液的pH 值調(diào)至10.31，檢測其吸收光譜；再滴加磷酸溶液將待測溶液pH 值調(diào)至3.68，檢測其吸收光譜；最后，滴加氫氧化鈉溶液，將待測溶液的pH 值調(diào)至10.31，再次檢測其吸收光譜。

1.6 穩(wěn)定性評估

1.6.1 光穩(wěn)定性 取R2Z、R2S 分別溶于pH 4.48 和pH 9.47 的PBS，置于紫外光下持續(xù)照射，分別于第10、30、60 和120 min 時，檢測各探針溶液的發(fā)射光譜。評估R2S、R2Z 在不同pH 條件下的光穩(wěn)定性，并比較同一pH條件下R2S和R2Z的光穩(wěn)定性差異。

1.6.2 結構穩(wěn)定性 將完成吸收光譜檢測的樣品于37 ℃下避光放置，分別于第6、12和24 h時，檢測各探針溶液的吸收光譜。評估R2S、R2Z 在不同pH 條件下的穩(wěn)定性，同時比較同一pH 條件下R2S 和R2Z的穩(wěn)定性差異。

1.7 細胞毒性實驗

取對數(shù)生長期的人結腸癌HCT-116細胞和人宮頸癌HeLa 細胞，接種于96 孔板繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的探針溶液或溶劑，孵育24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，并用PBS 洗滌2次，加入含有CCK-8 的培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，使用酶標儀測定各孔樣品溶液在450 nm處的吸光度值。

1.8 細胞膜通透性檢測

取對數(shù)生長期的HeLa 細胞，培養(yǎng)過夜后加入10 μmol/L 探針溶液，孵育2 h 后，用PBS 洗滌2 次。加入含有10 μg/mL Hoechst 的培養(yǎng)基孵育10 min，用PBS 洗滌2 次后，換新鮮培養(yǎng)基。在激光共聚焦顯微鏡下分別采用633 nm 激發(fā)波長，收集700～800 nm 通道下的熒光信號來觀測合成探針的成像情況，以及采用405 nm 激發(fā)波長，收集430～470 nm 通道下的熒光信號來觀測探針Hoechst的顯像，輔助亞細胞定位。

1.9 NIR成像實驗

1.9.1 體外NIR 成像 在48 孔板中，依次加入20 μmol/L 不同pH（6.00、6.50、7.00、7.50 和8.00）的探針溶液，采用740～790 nm 激發(fā)波長，收集810～860 nm通道下的熒光信號。

1.9.2 小動物NIR 成像初步探索 取2 只6 周齡BALB/c 雌性小鼠，通過尾靜脈分別注射10 μmol/L的R2S 和R2Z 探針溶液，于 第10 min、1 h、4 h、20 h、24 h進行活體成像。

參考SHI 等［25］的方法，取1 只6 周齡BALB/c 雌性小鼠，于其背部左側和右側分別皮下注射pH 6.50和pH 7.40 的PBS，5 min 后在對應部位分別注射50 μmol/L的R2S探針溶液，進行活體成像。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采 用Microsoft Excel、 GraphPad Prism 7.0 或Origin 2021 軟件處理相應數(shù)據(jù)。采用GraphPad Prism 7.0 軟件計算pKa和分析數(shù)據(jù)之間差異的統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)之間的比較采用非配對t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 化合物的結構鑒定

化合物5 為墨綠色固體，其分子結構（圖1）通過1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）進行鑒定，各峰的化學位移δ（峰型，耦合常數(shù)J，氫的數(shù)目）為：12.02 （寬峰，2H），8.25 （雙重峰，J=14.0 Hz，2H），7.80（單峰，2H），7.64（雙重峰，J=8.4 Hz，2H），7.44（雙重峰，J=8.4 Hz，2H），6.33（雙重峰，J=14.4 Hz，2H），4.21 （三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.67（單峰，12H），1.56（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。分子量通過MS（ESI+）測試進行驗證： 化學式為C42H50ClN2O10S2，［M+2H］+m/z理論值為843.26，測定值為843.36。

化合物6 為墨綠色固體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結果：δ 11.99（寬峰，2H），8.26（雙重峰，J=14.0 Hz，2H），7.64（雙重峰，J=7.6 Hz，2H），7.44（多重峰，4H），7.29（三重峰，J=7.2 Hz，2H），6.32（雙重峰，J=14.4 Hz，2H），4.22（三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=5.6 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.68（單峰，12H），1.55（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學式為C42H52ClN2O4，［M］+m/z理論值為683.36，測定值為683.41。

化 合 物7 （R2S） 為 深 藍 色 固 體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結果：δ 7.68（單峰，2H），7.59（多重峰，4H），7.18（雙重峰，J=8.0 Hz，2H），5.95（雙重峰，J=12.8 Hz，2H），4.03（多重峰，4H），3.74（多重峰，4H），3.16（多重峰，4H），3.06（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（多重峰，7H），1.72（多重峰，6H），1.63（單峰，12H），1.54（多重峰，4H），1.35（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學式為C47H61N4O10S2，［M+2H］+m/z理論值為907.38，測定值為907.54。根據(jù)分析型HPLC峰面積檢測化合物純度為95.7%。

化 合 物8 （R2Z） 為 深 藍 色 固 體。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）結果：δ 7.58（雙重峰，J=12.8 Hz，2H），7.51（雙重峰，J=7.2 Hz，2H），7.32（三重峰，J=7.8 Hz，2H），7.22（雙重峰，J=7.6 Hz，2H），7.11（三重峰，J=7.6Hz，2H），5.90（雙重峰，J=13.2 Hz，2H），3.99（多重峰，4H），3.72（多重峰，4H），2.61（多重峰，4H），2.46（多重峰，4H），2.33（單峰，3H），2.06（三重峰，J=5.8 Hz，4H），1.68（多重峰，2H），1.57（多重峰，16H），1.35（多重峰，4H），1.24（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化學式為C47H63N4O4，［M］+m/z理論值為747.48，測定值為747.46。根據(jù)分析型HPLC峰面積檢測化合物純度為92.8%。

2.2 探針的pH響應性檢測

通過對比在不同pH條件下探針溶液的吸收光譜和發(fā)射光譜，可以發(fā)現(xiàn)R2S、R2Z探針均具有明顯的pH響應性。隨著溶液酸性逐漸增強（從pH 11.10 到pH 3.47），R2S 和R2Z 的最大吸收波長（λAbsmax）分別由642 nm和662 nm紅移至774 nm和760 nm（圖2A、B），吸光度均明顯增強。同時，R2S和R2Z的λEmmax分別由794 nm和790 nm紅移至808 nm和804 nm（圖2C、D），且熒光強度也均有明顯升高。計算可得，R2S的斯托克斯位移（Stokes shift，即λEmmax和λAbsmax之間的差值）為64 nm，高于R2Z的斯托克斯位移44 nm（表1），說明R2S成像時發(fā)射光與激發(fā)光更易分辨，進而可更大程度地排除激發(fā)光的干擾。

表1 R2S與R2Z的光學參數(shù)Tab 1 Spectroscopic parameters of probes R2S and R2Z

圖2 R2S與R2Z在不同pH值下的吸收光譜及熒光光譜Fig 2 Absorption spectra and fluorescence spectra of the probes R2S and R2Z at different pH values

通過探針R2S、R2Z 相對熒光強度對pH 值的響應曲線（圖3），得到探針的pKa值分別為6.88、7.05，可以看出兩者對微酸性-中性環(huán)境（pH 6.4～7.4）的變化反應靈敏，最佳響應范圍與腫瘤所處環(huán)境相符，屬第二類pH響應性熒光探針。通過pH響應曲線的斜率求得，R2S 的pH 響應靈敏度數(shù)值為0.361 7，明顯高于R2Z（0.274 3）。

圖3 R2S與R2Z在不同pH值下的相對熒光強度Fig 3 Relative fluorescence intensity of probes R2S and R2Z upon different pH values

2.3 探針的pH響應可逆性及穩(wěn)定性

作為理想的pH 響應性探針，除了需要具有良好的光學性能，還需要具有較好的pH響應可逆性及穩(wěn)定性。通過吸收光譜檢測探針的pH響應可逆性，無論是將探針溶液由酸性調(diào)至堿性，還是由堿性調(diào)至酸性，R2S的吸收光譜變化在3個pH變化周期內(nèi)都是完全可逆的（圖4A）。但是R2Z僅表現(xiàn)出部分可逆性，當溶液pH由3.68調(diào)至10.31時，R2Z的吸收光譜在760 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰（圖4B），說明有新的物質生成。為了更好地評估探針在體溫（37 ℃）、不同pH條件的穩(wěn)定性，采用熒光發(fā)射光譜檢測探針的光穩(wěn)定性，采用吸收光譜檢測探針的結構穩(wěn)定性（圖4C、D）。結果發(fā)現(xiàn)R2Z在堿性（pH 9.47）條件下較為穩(wěn)定，但在酸性（pH 4.48）條件下穩(wěn)定性欠佳，而R2S無論在酸性和堿性條件下都顯示出了較高的穩(wěn)定性。

圖4 R2S與R2Z的pH響應可逆性和穩(wěn)定性Fig 4 Reversible changes toward cyclically adjusted pH and stabilities of probes R2S and R2Z

2.4 探針的細胞毒性評估

采用細胞（HCT-116細胞、HeLa細胞）毒性實驗來評價R2S與R2Z探針的安全性。對比R2S高濃度給藥組（100 μmol/L）與未給藥組，2組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖5A、C），說明探針對2種細胞沒有表現(xiàn)出明顯的生長抑制現(xiàn)象，具有良好的安全性。而應用R2Z處理HCT-116細胞，給藥濃度為50 μmol/L時，與未給藥組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007，圖5B）；處理HeLa細胞，給藥濃度為6.25 μmol/L時，與未給藥組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009，圖5D）。R2Z給藥組在工作濃度（12.5 μmol/L）時，細胞相對存活率已降至80%以下，說明該探針的安全性低于R2S。

圖5 R2S與R2Z對HCT-116細胞和HeLa細胞的毒性Fig 5 Cytotoxicity evaluation in HCT-116 and HeLa cells of probes R2S and R2Z

2.5 探針的細胞膜通透性測試

通過激光共聚焦顯微成像可在633 nm 通道下觀測到探針發(fā)出的熒光信號。對比R2S、R2Z 探針和Hoechst 發(fā)射熒光區(qū)域分布的異同，可以發(fā)現(xiàn)R2S 和R2Z 探針均主要分布于細胞質中（圖6），表明2 種合成探針均具有良好的細胞膜通透性。

圖6 R2S與R2Z的HeLa細胞成像Fig 6 Imaging of probes R2S and R2Z in HeLa cells

2.6 探針用于模擬TME的在體成像

使用小動物熒光成像系統(tǒng)檢測在48 孔板中不同pH 條件下探針溶液的成像差異。在pH 6.00～8.00 范圍內(nèi)，R2S、R2Z 探針的熒光強度均隨著pH 值的降低而升高，說明兩者均具有較好的pH 響應性，且可觀察到R2S的熒光強度高于R2Z（圖7A～C）。

注射熒光探針的實驗組小鼠飲食、活動正常，與未注射熒光探針的對照組小鼠狀態(tài)無異?；铙w和離體成像實驗結果表明R2S 主要分布于肝臟和腎臟，而R2Z 主要分布于肝臟（圖7D）。在小鼠背部皮下注射pH 6.50 和pH 7.40 的PBS，模擬腫瘤和正常組織的微環(huán)境，隨后注入R2S 后進行熒光成像（圖7E）。在檢測波長范圍內(nèi)pH 6.50側的熒光強度明顯高于pH 7.40側（圖7F），表明R2S 在模擬TME 的低pH 組織和正常pH組織中的成像具有明顯的區(qū)分度。

圖7 R2S與R2Z的體外與體內(nèi)NIR成像Fig 7 In vitro and in vivo NIR imaging of probes R2S and R2Z

3 討論

熒光基團經(jīng)特定波段的激發(fā)光照射后，電子吸收光能躍遷至激發(fā)態(tài)后不穩(wěn)定，隨即返回基態(tài)并發(fā)射另一波長（通常為更大波長）的光，產(chǎn)生熒光信號。連有熒光基團的探針分子可以與被測物質相結合，借助光學成像手段來實現(xiàn)對被測物質的定性及定量分析。在眾多不同結構的熒光基團中，花菁類熒光基團可通過改變其結構中共軛鏈的長度將其發(fā)射光譜范圍拓展至NIR波段，非常適合用于腫瘤成像。然而，大多數(shù)已報道［18，21-22］的花菁類熒光探針穩(wěn)定性欠佳，水溶性亦有待提高，同時其對腫瘤的選擇性有限，且成像過程中正常組織的背景信號過高。上述問題大大限制了花菁類熒光探針的進一步開發(fā)和應用。

在本研究中，我們合成得到了純度90%以上的水溶性pH 響應性花菁類NIR 熒光探針R2S。通過光譜學和NIR 成像檢測，我們發(fā)現(xiàn)探針R2S 對微酸性-中性環(huán)境具有較好的pH響應性。正如所設計的那樣，相較于R2Z，由于探針R2S中引入了磺酸基，其水溶性顯著增強，細胞毒性明顯降低，且仍保留了良好的細胞通透性。

此外，我們發(fā)現(xiàn)探針R2S在光學性能、穩(wěn)定性和pH 響應可逆性方面，皆大大優(yōu)于其脂溶性類似物R2Z。首先，在R2S 結構中，吲哚環(huán)上磺酸基的引入可使探針水溶性得以增強，而分子間堆積作用相應減弱，J 聚集體減少，Stokes 位移增大，量子產(chǎn)率增強［26-27］。其次，據(jù)我們推測，磺酸基的引入增大了單線態(tài)氧進攻的空間位阻，降低了單線態(tài)氧的進攻可能性［28］，使R2S展現(xiàn)出更為優(yōu)異的光穩(wěn)定性。此外，磺酸基是吸電子基團，將其引入至共軛結構中，可使共軛體系電子云密度下降，從而減少氫質子對化合物的親電進攻，使探針R2S在酸性條件下的穩(wěn)定性大大改善，而pH響應可逆性亦得以提升。

生物安全性和腫瘤特異性是腫瘤成像探針的重要評價標準。尾靜脈注射探針R2S 后，小鼠行為正常，與細胞毒性實驗結果共同證明探針具有較高的安全性。而通過皮下注射不同pH 的緩沖溶液來模擬“腫瘤組織”和“正常組織”微環(huán)境，原位注射探針R2S后的NIR成像結果表明“腫瘤組織”（低pH區(qū)域）呈現(xiàn)明顯增強的熒光信號，說明該探針對腫瘤微酸性環(huán)境具有較好的特異響應性。綜合以上兩方面，該探針展現(xiàn)出應用于腫瘤成像的廣闊前景。

在我們的設計中，R2S 探針的末端羧基提供了2個連接位點，可偶聯(lián)靶向肽［29］、納米顆粒［30］或其他分子，通過主動靶向或實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR），進一步加劇探針在腫瘤組織處富集，在TME特異性成像的基礎上進一步提高腫瘤組織的信號強度及腫瘤成像的信噪比，以實現(xiàn)腫瘤的精準成像及癌癥的精確診斷。

總之，本研究構建了一種性能優(yōu)良的水溶性pH響應性花菁類NIR 熒光探針R2S。探針R2S 對pH 變化響應靈敏、穩(wěn)定，最佳響應范圍與腫瘤所處微環(huán)境的pH 相符，且水溶性佳、穩(wěn)定性高、安全性好、具備共價標記的連接基團。該探針在腫瘤成像領域展現(xiàn)出了較強的在體成像應用潛力，為NIR熒光探針的設計與開發(fā)提供了新的思路和工具。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學實驗動物倫理與使用委員會的審核批準（文件號A2018027）。所有實驗過程均遵照《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》的條例進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by the Laboratory Animal Ethics and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University （Approval Letter No. A2018027），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of theImplementation Rules for the Management of Medical Laboratory Animals.

作者貢獻/Authors'Contributions

劉堅華、何偉娜、王雨心和孫瑞琪參與了實驗設計；王雨心和孫瑞琪參與了化學合成、純化和結構驗證；王雨心進行了光譜測試、細胞毒性測試、成像實驗和數(shù)據(jù)分析；王雨心、何偉娜、劉堅華參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Jianhua，HE Weina，WANG Yuxin and SUN Ruiqi. WANG Yuxin and SUN Ruiqi carried out the chemical synthesis，purification and structural verification.WANG Yuxin performed the spectroscopy test，cytotoxicity study，imaging experiments and data analysis.The manuscript was drafted and revised by WANG Yuxin，HE Weina and LIU Jianhua.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-19

·Accepted：2022-06-25

·Published online：2022-07-28