陳 永，汪保江，宋文聰，何 慧，趙 莉，張思為，唐中生，彭 娜，賴文娟，劉冬舟*

[1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院） 風(fēng)濕科，廣東 深圳 518020；2.深圳市婦幼保健院婦幼研究所，廣東 深圳 518047；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院） 健康管理中心，廣東 深圳518020；4.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院）中醫(yī)科，廣東 深圳 518020；5.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；6.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院 風(fēng)濕科，湖北 宜昌 443000]

在衰老的研究領(lǐng)域中，細(xì)胞老化或衰老顯示出與機(jī)體衰老的密切相關(guān)性，如在誘發(fā)原因、免疫原性、表觀遺傳學(xué)和分泌表型上都具有較大的重疊性[1]。細(xì)胞衰老的特征表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯、扁平或擴(kuò)大的形態(tài)、基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的表達(dá)和衰老相關(guān)分泌表型的獲得[2]。細(xì)胞老化模型也是衰老研究領(lǐng)域常用的手段之一，并發(fā)現(xiàn)衰老及細(xì)胞衰老可以通過(guò)改變代謝和基因重編程（Re-programme）等方法在一定程度上逆轉(zhuǎn)[3]。

滑膜成纖維細(xì)胞（Fibroblast synoviocytes, FLS）是關(guān)節(jié)滑膜的主要基質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，它是一到兩個(gè)細(xì)胞層，并且通過(guò)分泌關(guān)節(jié)滑液和蛋白聚糖等形成潤(rùn)滑和穩(wěn)定關(guān)節(jié)的作用[4]。但是在病理狀態(tài)下，F(xiàn)LS模擬癌細(xì)胞的增殖和遷移行為分泌大量炎癥因子、活化其它炎癥細(xì)胞，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要效應(yīng)細(xì)胞，也是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的熱門靶點(diǎn)[5-6]。甘草養(yǎng)陰湯（Gancao Nourish Yin Decoction, GCNY）是我院依據(jù)中醫(yī)理論開發(fā)的一款藥食同源配方（發(fā)明專利號(hào)：2019108435199、2021105153361），前期采用GCNY 藥物血清體外干預(yù)培養(yǎng)的原代FLS，證實(shí)GCNY 可抑制FLS 的增殖、遷移活性，提示對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在治療作用[7]。近年來(lái)，我們采用GCNY 直接體外干預(yù)MH7A（MIYAZAWA K 等[8]建立的一種永生化人類風(fēng)濕性FLS）時(shí)偶然間發(fā)現(xiàn)，GCNY 對(duì)于老化的MH7A顯示出促進(jìn)其活性的作用。這顯示出GCNY 對(duì)FLS在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期及細(xì)胞老化狀態(tài)下的不同調(diào)節(jié)作用。

為了進(jìn)一步研究GCNY 對(duì)于改善細(xì)胞衰老的作用機(jī)制，本研究對(duì)老化的FLS 在GCNY 干預(yù)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，為GCNY的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

3311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱、ST40 型離心機(jī)、51119600C型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；濾菌器（直徑0.22 μm，德國(guó)Merck 公司）；BD FACSCanto II 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson 公司）；Novaseq 6000 型二代測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司）；DM IL LED型顯微鏡 （德國(guó)Leica 公司）。

DMEM（高糖）培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11995500BT）、胎牛血清（貨號(hào)：10099）、TRIzol（貨號(hào)：15596026）、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液，貨號(hào)：SV30010）均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司。胰酶（貨號(hào)：R001100）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，貨號(hào)：D8537）均購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；CCK-8 檢測(cè)試劑（貨號(hào)：CK-04，日本Molecular Technology 公司）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1062S，上海碧云天公司）；甘草養(yǎng)陰湯（專利號(hào)：201910843519.9，自制）。

1.2 MH7A 細(xì)胞培養(yǎng)

MH7A 細(xì)胞購(gòu)自廣州吉尼歐生物科技有限公司，為第4 代，按照廠家說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代。培養(yǎng)條件：加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%胎牛血清、1%雙抗的DMEM（高糖）培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。每次傳代，以PBS 洗滌2 ～ 3 次、棄除未貼壁細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為2.5 g/mL 胰酶的消化液消化30 ～ 60 s，收集細(xì)胞進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)速度，及時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.3 藥物制備及實(shí)驗(yàn)分組

GCNY中藥飲片配方組成及比例為m甘草∶m人參∶m干姜∶m蒲公英∶m羅漢果∶m玉竹∶m大棗= 4 ∶3 ∶2 ∶2 ∶4 ∶3 ∶4。將中藥飲片加入適量蒸餾水進(jìn)行反復(fù)煎煮3 h，并濃縮、過(guò)濾去除藥渣。加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）調(diào)整濃度至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/mL，采用濾菌器（直徑0.22 μm）過(guò)濾2 次，加入1%雙抗，-20 ℃保存?zhèn)溆?。CCK-8 實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用MH7A細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋GCNY 至25 和50 μg/mL。對(duì)照組以培養(yǎng)基稀釋等體積PBS，GCNY 濃度為0。

1.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

對(duì)第12代衰老MH7A胰酶消化后，加入96孔板，每孔3×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞貼壁。輕柔吸取培養(yǎng)基，更換為含有不同濃度（0、25、50μg/mL）GCNY 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48 和72 h 時(shí)加入CCK-8 檢測(cè)試劑，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔的OD。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每次實(shí)驗(yàn)每組5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將第12 代衰老MH7A 胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為106/ mL，加入6孔板，每孔加入2 mL。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后貼壁、棄上清。以含終濃度為GCNY 0 和50μg/mL 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集2 組的每孔細(xì)胞。按Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，其中，Q2 期為早期凋亡細(xì)胞，Q4 為晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每次實(shí)驗(yàn)每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)二代測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

細(xì)胞處理方式同“1.4”。將對(duì)照組（0）和GCNY組（50μg/mL）的MH7A 收集至EP 管，加入1 mL TRIzol?提取總RNA。RNA 高通量測(cè)序由武漢康測(cè)科技有限公司進(jìn)行。將2μg 總RNA 用于測(cè)序文庫(kù)制備。使用 Novaseq 6000 測(cè)序儀、PE150 模型對(duì)對(duì)應(yīng)于200 ～ 500 bps 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行富集、定量和測(cè)序。原始測(cè)序數(shù)據(jù)由Trimmomatic（v. 0.36）過(guò)濾，丟棄低質(zhì)量讀數(shù)、修剪被接頭序列污染的讀數(shù)。使用STRA軟件（v. 2.5.3a）進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理，參照基因組為UCSC 人類基因組參考聯(lián)盟（Genome Reference Consortium Human Genome Build 38，GRCH38）(https://genome.ucsc.edu/)。通過(guò)特征計(jì)數(shù)（Subread-1.5.1；Bioconductor）計(jì)算映射到每個(gè)基因外顯子區(qū)域的讀數(shù)，然后使用edgeR 包對(duì)讀數(shù)進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算CPM 值（counts per million)并對(duì)數(shù)據(jù)取log2 值。數(shù)據(jù)質(zhì)控箱圖、DEG 火山圖使用R 軟件中的ggplot2包（v.3.3.3）作圖。使用R 軟件（v.3.6.3）中DESeq2包（1.26.0 版）鑒定兩組之間的差異基因（DEG）。P＜0.05 及差異倍數(shù)（FC）大于1.5 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用clusterProfiler 包（v.4.1.1）對(duì)DEG 進(jìn)行基因GO 功能富集，P＜0.05 通路具有顯著性。DEG熱圖使用R 軟件中的pheatmap 包（v.1.0.12）作圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad prism 7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老MH7A 細(xì)胞培養(yǎng)

MH7A 細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約3 ～ 4 d 可傳一代。在傳代到10 代以后，增殖速度明顯下降。在12 代以后衰老的細(xì)胞，增殖速度放緩，約8 ～ 10 d 可傳一代。在16 代以后的MH7A 細(xì)胞，生長(zhǎng)速度極度緩慢，無(wú)法培養(yǎng)成功。衰老細(xì)胞呈現(xiàn)衰老特征的高亮反射的細(xì)胞比例增多，見圖1。

2.2 GCNY 促進(jìn)老化MH7A 增殖活性

通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，GCNY 促進(jìn)MH7A 細(xì)胞增殖活性。相對(duì)于對(duì)照組（0μg/mL），在干預(yù)48 h 時(shí)，GCNY（50μg/mL）的OD值明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；干預(yù)72 h 時(shí)，GCNY（50μg/mL）OD值明顯高于對(duì)照組和低濃度組（25 μg/mL）（P＜0.05）。GCNY 呈一定劑量依賴性（25 和50 μg/mL）在48 ～72 h 促進(jìn)老化MH7A 細(xì)胞增殖，見圖2。

2.3 GCNY 抑制老化MH7A 凋亡

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GCNY（50 μg/mL）相對(duì)于對(duì)照組可明顯下降衰老MH7A 早期凋亡細(xì)胞（Q2）比例，顯示出對(duì)老化MH7A 凋亡水平的抑制作用，見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

2.4.1 GCNY 對(duì)衰老MH7A 轉(zhuǎn)錄組的影響及DEGs 富集通路 對(duì)原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，送檢樣本的基因表達(dá)量一致，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，見圖4A。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示GCNY 使衰老MH7A 顯著上調(diào)基因127 個(gè)，下調(diào)基因101 個(gè)，見圖4B。

上調(diào)基因主要富集于肌肉收縮（muscle contraction）、肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞收縮（actin-mediated cell contraction）、腺苷酸環(huán)化酶激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路（adenylate cyclase-activating G proteincoupled receptor signaling pathway）、cAMP 介 導(dǎo) 的 信號(hào)傳導(dǎo)（cAMP-mediated signaling），肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架（actin cytoskeleton）、微絲運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（microfilament motor activity）和電壓門控通道活動(dòng)（voltage-gated channel activity）等通路，見圖5A。下調(diào)基因主要富集于調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞分化（regulation of vascular smooth muscle cell differentiation）、皮質(zhì)細(xì)胞骨架組織（cortical cytoskeleton organization）、細(xì)胞皮層（cell cortex）、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix）、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性RNA 聚 合 酶II- 特 異 性（DNA-binding transcription activator activity RNA polymerase II-specific）、 成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（fibroblast growth factor receptor binding）等通路，見圖5B。

2.4.2 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的最顯著DEG 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序研究顯示，最顯著上調(diào)的mRNA 包括肌球蛋白重鏈13（MYH13）、BRCA1 關(guān)聯(lián)的ATM 激活器1（BRAT1）、Gem 相 關(guān) 蛋 白7（GEMIN7）、RELB 原癌 基 因（RELB）、NF-KB 亞 基（NF-KB Subunit）、RNA-7SK 小核假基因（255RN7SKP255）、超極化激活環(huán)核苷酸門控鉀通道3（HCN3）、RN7SK 假基因203（RN7SKP203）、和原肌球蛋白3 假基因8（TPM3P8）等（見圖6A、B）。最顯著下調(diào)的mRNA 包括賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶2B（KAT2B）、含有WD 重復(fù)序列的蛋白質(zhì)63（WDR63）、TTK 蛋白激酶（TTK）、具有序列相似性 101 的家族-成員A（Member AFAM101A）、鋅指蛋白883（ZNF883）、雙皮質(zhì)素樣激酶1（DCLK1）、IL-33 等（見圖6A、C）。

3 討論

GCNY 配伍中，甘草益氣補(bǔ)中、清熱解毒為君藥；人參補(bǔ)氣生津，玉竹養(yǎng)陰潤(rùn)燥，協(xié)調(diào)甘草作用，并消除其水鈉潴留的副作用，為臣藥。蒲公英、羅漢果清熱解毒，干姜溫中散寒，回陽(yáng)通脈，屬于佐藥；大棗養(yǎng)血安神、緩和藥性為使藥。整個(gè)配方陰陽(yáng)調(diào)和、滋陰為主，陰中求陽(yáng)；對(duì)機(jī)體的陰陽(yáng)失調(diào)形成了“緩沖液”樣的作用。在本次研究中，我們偶然發(fā)現(xiàn)GCNY 對(duì)衰老的FLS（MH7A）生物學(xué)功能顯示出促進(jìn)細(xì)胞增殖活力與之前對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FLS 所闡述的抑制作用不同[7]。這一發(fā)現(xiàn)使得我們對(duì)于GCNY 對(duì)衰老MH7A 的影響產(chǎn)生了興趣。流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，GCNY 對(duì)于衰老MH7A 早期凋亡的抑制作用。細(xì)胞的增殖活力是細(xì)胞狀態(tài)的重要標(biāo)志，衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、增殖活性下降[9]。細(xì)胞衰老是機(jī)體衰老的機(jī)制之一，其相關(guān)基因也是老年相關(guān)疾病的致病基因[10]。

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，我們發(fā)現(xiàn)GCNY 上調(diào)了衰 老MH7A 的MYH13、BRAT1、GEMIN7、RELB、RN7SKP255、HCN3、RN7SKP203 和TPM3P8 等127個(gè)基因的表達(dá)水平。在例舉的這些最顯著DEG 中，RN7SKP255、RN7SKP203 和TPM3P8 目前被認(rèn)定為偽基因，RELB 基因在功能方面的研究顯示出促進(jìn)細(xì)胞增殖的癌基因（生長(zhǎng)基因）特點(diǎn)，并參與炎癥反應(yīng)的機(jī)制。近來(lái)研究顯示HCN3 促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[11]。BRAT1 編碼的蛋白質(zhì)與腫瘤抑制蛋白BRCA1 及ATM 蛋白（細(xì)胞周期檢查點(diǎn)信號(hào)通路的主控制器）相互作用，是應(yīng)對(duì)電離輻射等導(dǎo)致DNA 損傷作出反應(yīng)的重要基因[12]。MYH13 還顯示通過(guò)調(diào)控FOXP2 基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控神經(jīng)發(fā)育和退行性變[13]。GEMIN7 是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活（survival of motor neurons，SMN）復(fù)合物的蛋白成分，直接與SMN 和GEMIN6 相互作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)的重要功能[14]。

GCNY 對(duì)于衰老導(dǎo)致抑制細(xì)胞活性的相關(guān)基因具有抑制作用。例如在下調(diào)的101 個(gè)顯著DEG 中，以KAT2B、WDR63、TTK、FAM101A、ZNF883、DCLK1、IL33 等最為顯著。KAT2B 參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，對(duì)于KAT2B 乙?；难芯匡@示，該靶點(diǎn)可抑制中心體擴(kuò)增[15]。WDR63 顯示出促進(jìn)下游p53 表達(dá)，同樣扮演抑癌基因的角色[16]，并且p53 也是重要的衰老基因[17]。TTK 編碼的蛋白是一種關(guān)鍵的有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白，在癌癥的研究中體現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用[18]。FAM101A 的主要功能是參與肌動(dòng)蛋白絲束形成，但在骨和軟骨的形成中起負(fù)性調(diào)節(jié)[19]。ZNF883 在肺癌的研究中被認(rèn)為是癌癥高甲基化1（HIC1）的下游基因，該通路負(fù)性調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖，與預(yù)后負(fù)相關(guān)[20]。另外GCNY 在衰老的MH7A細(xì)胞中仍然顯示抑制炎癥因子的功效，如IL33 是IL-1 家族的成員，可激活TH2 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、TH1 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞[21]。這些靶點(diǎn)的下調(diào)支持GCNY 增強(qiáng)衰老細(xì)胞的活力、抑制炎癥方面的作用。另外下調(diào)的DCLK1 在癌癥干細(xì)胞中的表現(xiàn)出多種生物學(xué)過(guò)程，是原癌基因范疇[22]，提示GCNY 對(duì)相關(guān)癌癥耐藥、轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值，相關(guān)機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究證明GCNY 對(duì)衰老的MH7A 細(xì)胞表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖活力、抑制早期凋亡的作用，對(duì)于衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、代謝層面的調(diào)整作用?；贛H7A良好的成纖維細(xì)胞特征，結(jié)果提示GCNY 在增強(qiáng)衰老細(xì)胞活力的潛在運(yùn)用價(jià)值。課題組前期研究結(jié)果顯示GCNY 能夠抑制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滑膜成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，說(shuō)明GCNY 可能對(duì)不同狀態(tài)下的細(xì)胞活力產(chǎn)生雙向作用。本次研究也為進(jìn)一步相關(guān)探索提供了可靠的靶點(diǎn)，相關(guān)生理作用效果需進(jìn)一步驗(yàn)證。