米卓爾，崔雨晴，陳方超，周丹丹，沙禕煒

[鑒甄檢測(cè)技術(shù)（上海）有限公司，上海 200131］

通天口服液是以出自宋代的《太平惠民和劑局方》中醫(yī)經(jīng)典名方“川芎茶調(diào)散”為基礎(chǔ)的中藥制劑[1]，由川芎、赤芍、天麻、羌活、白芷、細(xì)辛、菊花、薄荷、防風(fēng)、茶葉、甘草等11 味中藥組成，具有活血化瘀、祛風(fēng)止痛之功效[2]。現(xiàn)代臨床研究表明，通天口服液主要用于偏頭痛的治療[3-6]，具有抗炎作用[7]。此外，其對(duì)于腦梗死恢復(fù)期也具有良好療效[8]。

2020 年版 《中國(guó)藥典》（一部）中通天口服液僅對(duì)芍藥苷進(jìn)行質(zhì)量控制，已有文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法也存在一定的局限性，如選擇指標(biāo)性成分不夠全面[9-13]、測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)[1]等。中藥復(fù)方往往是多成分協(xié)同發(fā)揮作用起到疾病防治的效果，多味藥多組分的質(zhì)量控制可以更好地體現(xiàn)其質(zhì)量的整體性和系統(tǒng)性。本研究以君、臣藥為主，兼顧佐使藥的原則，采用多成分定量結(jié)合指紋圖譜的方法，建立了通天口服液的指紋圖譜方法，對(duì)21 個(gè)共有峰進(jìn)行標(biāo)定；同時(shí)對(duì)其中9 個(gè)活性成分進(jìn)行定量控制（咖啡因、芍藥苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯）。該方法簡(jiǎn)單、可靠、耐用性良好，可更加全面、系統(tǒng)地控制通天口服液的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters Alliance e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司)；乙腈和甲醇（色譜純，dama-betas）；磷酸（色譜純，F(xiàn)isher）；甲醇和乙醇（分析純，上海泰坦科技）；超純水（實(shí)驗(yàn)室制備）；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201906，純度：91.50%）、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：101149-201903，純度：100.00%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-202018，純度：96.1%）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-201810，純度：93.50%）、紫花前胡苷對(duì)照品（批號(hào)：111821-201604，純度：99.60%）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-202007，純度：98.10%）、蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)：111528-202112，純度：98.00%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)：7969，純度：94.60%）、異綠原酸A 對(duì)照品（批號(hào)：7123，純度：93.60%）、水合氧化前胡素對(duì)照品（批號(hào)：9028，純度：99.70%）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：8779，純度：98.90%）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：8155，純度：97.40%）均購(gòu)自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：PRF20030243，純度：98.88%）、新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：PRF10080702，純度：98.00%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：PRF10110102，純度：98.77%）、氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：PRF21012822，純度：98.00%）、巴利森苷B 對(duì)照品（批號(hào)：PRF21030901，純度：98.00%）、異綠原酸B 對(duì)照品（批號(hào)：PRF20070205，純 度：98.00%）、 異 綠 原 酸C 對(duì) 照 品（ 批 號(hào)：PRF20022503，純度：98.00%）、甘草酸銨（批號(hào)：PRF20011002，純度：99.63%）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。15 批通天口服液S1-S15（批號(hào)：19080030、19080031、19080032、19080033、19080034、9080035、19080036、19080037、19080038、19080040、19080041、19080042、19080043、19080044、19080045）以及陰性制劑均由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取20 個(gè)對(duì)照品適量，精密稱定，分別加75%甲醇制成各成分含量約為0.5 mg/mL 的儲(chǔ)備液。分別精密吸取各個(gè)儲(chǔ)備液適量，用75%甲醇水稀釋制成合適濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取本品1 mL，置5 mL 容量瓶中，加75%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性樣品溶液同法制備。

2.3 色譜條件

Waters XSelect CSH C18柱（4.6 mm × 150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）（V/V），梯度洗脫（0 ～ 4 min，4%A；4 ～ 10 min，4%→10%A；10 ～ 14 min，10%→13%A；14 ～ 20 min，13%A；20 ～ 22 min，13% →17%A；22 ～ 30 min，17%→18%A；30 ～ 38 min，18%→25%A；38 ～ 50 min，25%→35%A；50 ～ 53 min，35%→45%A；53 ～ 63 min，45%→68%A；63 ～ 64 min，68%→95%A；64 ～ 66 min，95%A；66 ～ 67 min，95% →4%A；67 ～ 70 min，4%A），記錄時(shí)間：65 min；流速：0.8 mL/min；二極管陣列（PDA）檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm （芍藥苷）、254 nm （升麻素苷、甘草酸銨、指紋圖譜）、280 nm （咖啡因）、315 nm （紫花前胡苷、水合氧化前胡素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、藁本內(nèi)酯）；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 指紋圖譜測(cè)定

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以3 號(hào)峰（咖啡因）為參照峰S，21 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD 在0.01%～0.29%，相對(duì)峰面積RSD在0.33% ～ 3.42%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 專屬性試驗(yàn) 取空白、對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液按“2.3”項(xiàng)進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。空白溶液對(duì)測(cè)定無干擾，指認(rèn)的色譜峰的紫外光譜圖與對(duì)照品一致，各峰之間分離度良好，表明方法專屬性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號(hào)：19080040），按“2.2”項(xiàng)方法平行制備 6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以3 號(hào)峰（咖啡因）為參照峰S，21 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.01% ～0.26%之間，相對(duì)峰面積RSD 在0.19% ～ 3.67%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：19080040），分別在室溫下放置0、3.5、7、10.5、14、24 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以3 號(hào)峰（咖啡因）為S，21 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 在0.10%～2.16%，相對(duì)峰面積RSD 在0.80%～4.32%，表明樣品在 24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 指紋圖譜的建立與共有峰的標(biāo)定 按“2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定對(duì)照品及供試品溶液，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.13723版本）”軟件對(duì)15 批通天口服液指紋圖譜進(jìn)行處理，建立了對(duì)照指紋圖譜，見圖2。經(jīng)Mark 峰匹配后，確定了21 個(gè)共有峰，通過比對(duì)各對(duì)照品的保留時(shí)間及PDA 光譜圖，指認(rèn)出19 個(gè)峰，峰3（咖啡因）歸屬于茶葉，峰4（氧化芍藥苷）和峰7（芍藥苷）歸屬于赤芍，峰8（升麻素苷）歸屬于防風(fēng)，峰9（紫花前胡苷）和峰19 歸屬于羌活、峰10（木犀草苷）、峰11（芹菜素-7-O-葡萄糖苷）、峰12（異綠原酸B）、峰13（異綠原酸A）、峰15（異綠原酸C）歸屬于菊花，峰14（迷迭香酸）和峰17（蒙花苷）歸屬于薄荷，峰16（水合氧化前胡素）歸屬于白芷和羌活，峰18（甘草酸銨）歸屬于甘草，峰20（藁本內(nèi)酯）和峰21 歸屬于川芎。相似度結(jié)果見表1，結(jié)果表示，15 批供試品與相似度均大于0.95，表明15 批通天口服液的主要化學(xué)成分具有較好的一致性。

表1 15 批通天口服液相似度Tab. 1 Similarity of 15 batches of Tongtian oral solution

2.5 多成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液（咖啡因167.7μg/mL、芍藥苷461.3μg/mL、升麻素苷16.2μg/mL、紫花前胡苷191.1μg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷20.0μg/mL、水合氧化前胡素14.5μg/mL、蒙花苷48.6μg/mL、甘草酸銨30.5μg/mL、藁本內(nèi)酯14.3μg/mL），用75%甲醇逐級(jí)稀釋配制為7 個(gè)不同濃度，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及線性范圍，見表2。結(jié)果表明各自成分在各線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 通天口服液中 9 個(gè)成分的回歸方程及線性范圍Tab. 2 Regression equation and linear range of 9 components in Tongtian oral solution

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：19080040），按“2.3”項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣 6 次分析，記錄峰面積。結(jié)果表明，咖啡因、芍藥苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為0.34%、0.46%、0.43%、0.28%、0.37%、0.27%、0.38%、0.99%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：19080040），分別在室溫下放置0、3.5、7、10.5、14、24 h，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，咖啡因、芍藥苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為0.81%、1.07%、1.31%、1.10%、1.22%、1.30%、0.95%、1.02%、0.61%，表明樣品在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號(hào)：19080040），按“2.2”項(xiàng)方法平行制備 6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積?？Х纫颉⑸炙庈铡⑸樗剀?、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別0.29%、0.32%、0.59%、0.41%、2.43%、0.58%、0.69%、0.40%、0.89%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的通天口服液0.5 mL（批號(hào)：19080040），精密加入3 mL 的混合對(duì)照品溶液（咖啡因0.063 mg/mL、芍藥苷0.157mg/mL、升麻素苷0.003 g/mL、紫花前胡苷0.072 mg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.008 mg/mL、水合氧化前胡素0.005 mg/mL、蒙花苷0.015 mg/mL、甘草酸銨0.016 mg/mL、藁本內(nèi)酯0.004 mg/mL），加入75%甲醇定容至刻度（加入量與所取通天口服液中各指標(biāo)成分量之比為1 ∶1）,按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。各成分的回收率和RSD 均符合標(biāo)準(zhǔn)，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 通天口服液中 9 個(gè)成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab. 3 The results of recoveries of 9 chemical components in Tongtian oral solution（n = 6）

2.5.6 樣品的測(cè)定 精密移取15 批樣品，按照按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行制備3 份，按“2.3”項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄峰面積。咖啡因、芍藥苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯的含量及RSD 值見表4。

表4 15 批通天口服液中 9 個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）Tab. 4 The results of 9 components in 15 batchs of Tongtian oral solution（n = 3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

通天口服液組方中，川芎活血祛瘀、行氣開郁、祛風(fēng)止痛為君藥。羌活、白芷、天麻合用，解表散寒、祛風(fēng)勝濕，與川芎相須配伍，共為臣藥；赤芍、薄荷、防風(fēng)、菊花、細(xì)辛共為佐藥。甘草、茶葉調(diào)和諸藥，兼為使藥。諸藥合用，共奏祛風(fēng)止痛、通暢氣血之功。為了整體地、全面地評(píng)價(jià)通天口服液的質(zhì)量，本研究以君臣為主，兼顧佐使的原則，選擇咖啡因、芍藥苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯 9 個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行定量研究。本研究所建立的指紋圖譜結(jié)合同步測(cè)定9 種成分的定量的方法，全面涵蓋了君臣佐使藥的化學(xué)定量信息 ，可整體性地評(píng)價(jià)通天口服液的內(nèi)在質(zhì)量 。

3.2 色譜條件的確定

以色譜峰數(shù)量及響應(yīng)強(qiáng)度作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)選擇的指標(biāo)，最終確定為254 nm 作為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。天麻中巴利森苷B 的最大紫外吸收波長(zhǎng)為230 nm，因其在制劑中的含量較低，故在254 nm 無法檢測(cè)。

參考各對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)，最終確定以230、254、280、315 nm 作為9 個(gè)成分含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。甲醇的洗脫能力較乙腈弱，且柱壓較高，從節(jié)約時(shí)間和保護(hù)色譜柱壽命的角度考慮，故選擇使用乙腈-水體系。采用乙腈-水洗脫時(shí)，色譜峰整體圖譜較差，基線漂移，且無法檢測(cè)甘草酸。通過加酸來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH 值：考察乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.01%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液對(duì)色譜峰的影響。與甲酸相比，磷酸可使基線更加平穩(wěn)，其中0.05%磷酸水溶液呈現(xiàn)較好的色譜行為?？疾觳煌纳V柱對(duì)樣品的分離效果，發(fā)現(xiàn)Waters X-select CSH C18柱最優(yōu)，尤其對(duì)紫花前胡苷的分離具有良好效果，可達(dá)到基線分離。

3.3 對(duì)測(cè)定結(jié)果的思考

15批通天口服液的指紋圖譜相似度均大于0.95，產(chǎn)品整體批間差異不大，指紋圖譜方法可行，為提高通天口服液內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。由9 個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果可知，揮發(fā)性成分蒙花苷、藁本內(nèi)酯不同批次含量差異較大，分析其原因可能是生產(chǎn)所用原藥材的質(zhì)量差異較大，例如藥材的生產(chǎn)基地、采收時(shí)間、運(yùn)輸條件及儲(chǔ)存條件不同導(dǎo)致，此結(jié)果可為企業(yè)控制藥材來源提供數(shù)據(jù)支撐，更好地把控藥材來源。

4 結(jié)論

中藥復(fù)方成分復(fù)雜多樣，指紋圖譜結(jié)合多組分的定量研究可以更好地體現(xiàn)其質(zhì)量的整體性和系統(tǒng)性。所建立的方法可對(duì)組方中的9 個(gè)藥味進(jìn)行質(zhì)量控制，提高了藥品質(zhì)量的可控性。本法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，耐用性及重現(xiàn)性好，為保證產(chǎn)品批間穩(wěn)定性提供了數(shù)據(jù)支持，也為其標(biāo)準(zhǔn)提升提供了參考依據(jù)。