王相安，張 勻，王慧銘

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 營養(yǎng)科，浙江 杭州 310003；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種常見的全身代謝性骨病，以鈣化的骨組織減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞及易并發(fā)脆性骨折為特征，有數(shù)據(jù)顯示，我國65 歲以上人群OP 患病率高達(dá)32%，其中以女性居多[1]。目前西醫(yī)治療OP，主要是雙膦酸鹽、降鈣素、甲狀旁腺素、雌激素等藥物，但存在毒副作用大及較高經(jīng)濟(jì)成本等缺點(diǎn)[2]。有研究表明，長期服用雌激素類藥物會(huì)增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的患病率，而長期服用雙磷酸鹽類藥物會(huì)導(dǎo)致頜骨壞死[3-4]。

中醫(yī)學(xué)將OP 歸為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，發(fā)病與腎精虧虛、氣滯血瘀關(guān)系密切，治療當(dāng)以活血化瘀、補(bǔ)腎健骨為主[5]。骨松寶顆粒是由淫羊藿、續(xù)斷、地黃、三棱、莪術(shù)、知母、牡蠣、赤芍、川芎等組成的中藥制劑，諸藥配伍，起到補(bǔ)腎活血、強(qiáng)筋壯骨之功效，被廣泛應(yīng)用于OP 的治療中并取得良好的臨床療效[6-7]。但由于組方復(fù)雜及現(xiàn)有研究方法的局限性，骨松寶顆粒治療OP的藥效機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，通過大量網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源，對(duì)作用的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，從微觀藥理調(diào)控基因表達(dá)的角度闡釋藥物多途徑、多靶點(diǎn)治療疾病的機(jī)理，符合中醫(yī)“整體觀”理論[8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)骨松寶顆粒的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、基因通路等方面進(jìn)行分析，并通過分子對(duì)接方法驗(yàn)證活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力, 從而為其治療OP 的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com），Gene Cards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org），TCMID 數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid），OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org），ETCM 數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/ETCM），UniProt 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.uniprot.org），STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org），PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org），Venny 2.1.0在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），Cytosape 3.7.2 軟件，AutoDock Vina 1.1.2 軟件，Chem3D軟件，PYMOL2.3.0 軟件。

1.2 方法

1.2.1 中藥活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，檢索淫羊藿、續(xù)斷、三棱、莪術(shù)、知母、赤芍、川芎的活性成分。由于地黃根據(jù)炮制方法不同，分為鮮地黃、生地黃和熟地黃，但TCMSP中只有熟地黃的條目，故通過TCMID 及ETCM 數(shù)據(jù)庫并結(jié)合中國知網(wǎng)、PubMed 等數(shù)據(jù)庫查閱相關(guān)文獻(xiàn)以補(bǔ)充地黃的活性成分[9]。由于TCMSP 中沒有牡蠣的條目，故通過中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索牡蠣，根據(jù)CAS 號(hào)在Pubchem 數(shù)據(jù)庫找到化合物，最后根據(jù)口服利用度OB ≥30%且類藥性DL ≥0.18 為條件對(duì)上述所有化合物進(jìn)行篩選，以獲取主要的活性成分并導(dǎo)入TCMSP 中，檢索與之對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，同時(shí)利用UniProt 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“homo sapiens”，校準(zhǔn)靶點(diǎn)的基因信息，得到標(biāo)準(zhǔn)化的靶點(diǎn)名稱。

1.2.2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用篩選出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 上繪制“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)行Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree 值大小篩選出核心成分。

1.2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 利用Gene Cards 數(shù)據(jù)庫（Relevance Score ≥1.0）和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“osteoporosis”作為檢索詞進(jìn)行檢索，合并去除重復(fù)值后，最終獲得骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)。

1.2.4 “藥物-疾病”共同靶點(diǎn)的篩選 將骨松寶顆粒的靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)取交集，并利用Venny 2.1.0在線軟件繪制Venn 圖，得到“藥物-疾病”共靶基因。

1.2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.2.4” 項(xiàng)下獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 為條件篩選，獲取蛋白相互作用關(guān)系，得到“TSV”格式文件，并導(dǎo)入Cytosape 3.7.2 中，運(yùn)行CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）等參數(shù)篩選出核心靶基因。

1.2.6 通路和功能富集分析 將“1.2.4”項(xiàng)下獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，將生物種類設(shè)定為“homo sapiens”，根據(jù)P< 0.01，進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路分析，并利用R 語言可視化。

1.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 在PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得核心活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Chem3D 優(yōu)化后獲得“MOL2”格式的3D 結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用AutoDock 4.2.6 加氫、分配電荷及設(shè)置可旋轉(zhuǎn)柔性鍵后保存為“pdbqt”文件。在PDB 數(shù)據(jù)庫尋找靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PYMOL 2.3.0 中對(duì)其去除水分子及配體后，再利用AutoDock 4.2.6 加氫、分配電荷后保存為“pdbqt”文件。最后，利用AutoDock Vina 1.1.2 將受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接并用PYMOL2.3.0 可視化。

2 結(jié)果

2.1 中藥的活性成分和作用靶點(diǎn)收集

通過檢索及設(shè)定OB ≥30%且DL ≥0.18 為條件篩選并剔除沒有相應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分后，共獲取60 種活性成分，其中，淫羊藿20 種，川芎5 種，知母9 種，赤芍11 種，續(xù)斷3 種，三棱3 種，地黃1種，莪術(shù)1 種，牡蠣2 種，以及5 種共有活性成分，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫校準(zhǔn)所有靶點(diǎn)名稱，去除重復(fù)及無效值后共得到266 個(gè)靶點(diǎn)。為方便后續(xù)研究，按藥物的首字母縮寫進(jìn)行編碼，其中赤芍活性成分被標(biāo)記為CS1-CS11，以此類推，淫羊藿、川芎、地黃、牡蠣、續(xù)斷、知母、莪術(shù)、三棱的活性成分分別被標(biāo)記為YYH1-YYH20；CX1-CX5；DH1；ML1-ML2；XD1-XD3；ZM1-ZM9；ES1；SL1-SL3。5 種共有活性成分被標(biāo)記為A1-E1。

2.2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape3.7.2 繪制“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中共含有335 個(gè)節(jié)點(diǎn)（9 個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、60 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、266 個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1 229 條邊。通過內(nèi)置的Network Analyzer分析該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，并根據(jù)degree 值大小選取排名前7 的核心成分，見表1。

表1 骨松寶顆粒的核心活性成分信息Tab.1 Information of core-components of Gusongbao granules

2.3 骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)的收集與韋恩圖的構(gòu)建

利用Gene Cards 數(shù)據(jù)（Relevance Score ≥1.0）庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，檢索骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)合并刪除重復(fù)值后,共得到1 220 個(gè)靶點(diǎn)，與骨松寶顆粒相關(guān)的266 個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入Venny 2.1.0 在線軟件進(jìn)行交集分析并繪制Venn 圖，共獲得88 個(gè)交集靶點(diǎn)，即為骨松寶顆粒治療骨質(zhì)疏松的潛在作用靶點(diǎn)，見圖2。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將88 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種“Homo sapiens”，設(shè)置置信度≥0.4，剔除1 個(gè)無相互作用關(guān)系的蛋白后，得到由87 個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 498條邊組成的PPI 網(wǎng)絡(luò)及“TSV”格式文件，見圖3。將“TSV”格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中，運(yùn)行CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算出DC、CC及BC 的值。其中，DC 的中位數(shù)為32，CC 的中位數(shù)為0.61，BC 的中位數(shù)為28.18，第一輪篩選設(shè)為DC ≥32，CC ≥0.61，BC ≥28.18，共得到37 個(gè)靶點(diǎn)。第二輪篩選設(shè)為DC ≥49，CC ≥0.69，BC ≥74，共得到17 個(gè)靶點(diǎn)。最后設(shè)定DC ≥61，CC ≥0.76，BC≥178.18進(jìn)行第3次篩選,最終得到8個(gè)核心靶點(diǎn)，即IL6、AKT1、TNF、VEGFA、IL1B、TP53、JUN、MMP9。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用Metascape 平臺(tái)，設(shè)置P< 0.01 作為篩選條件，將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）分析，總共富集到1 570 個(gè)條目，其中，1 419 項(xiàng)BP，105 項(xiàng)MF，46 項(xiàng)CC，根據(jù)?lgP 值篩選出排名前10 的條目，并利用R 語言繪制柱狀圖，見圖4。其中，BP 主要涉及對(duì)激素、胰島素及有機(jī)氮化合物的反應(yīng)等；CC 主要涉及RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄抑制因子等；MF 主要涉及信號(hào)受體激活因子活性、絲氨酸水解酶活性、內(nèi)肽酶活力等。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平臺(tái)，設(shè)置P< 0.01 作為篩選條件，將交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，共得到187 條信號(hào)通路，根據(jù)?lgP 值篩選出排名前20 條目，并利用R 語言繪氣泡圖，見圖5。主要涉及等MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT及FoxO 等信號(hào)通路，同時(shí)，為了進(jìn)一步探索排名前7 的活性成分及其靶點(diǎn)在疾病通路中發(fā)揮的作用，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

使用AutoDock Vina 1.1.2 對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。結(jié)合能值越低，二者的結(jié)合效果越好，通常以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，各靶點(diǎn)和活性成分之間對(duì)接的最低結(jié)合能結(jié)果均小于-5.0 kJ/mol，說明活性成分與受體蛋白具有較好的結(jié)合活性。其中，分子對(duì)接模式圖見圖7。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的結(jié)合能Tab. 2 Binding energy of core active ingredient and core target protein

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出骨松寶顆粒60 個(gè)潛在活性成分，其中，山柰酚、槲皮素、木犀草素、脫水淫羊藿素、芒柄花黃素等具有較高的度值，為骨松寶顆粒發(fā)揮作用的關(guān)鍵藥效成分。有研究指出，槲皮素可抑制核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成、成骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等諸多生物過程，同時(shí)刺激滋養(yǎng)血管及骨量的生成[10]。VAKILI S 等[11]通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素可以調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的自噬和凋亡，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松。木犀草素可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)ERK/LRP-5/GSK-3β 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，從而減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松[12]。ZHENG Z G 等[13]通過STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)脫水淫羊藿素作為SREBP2 抑制劑，可以抑制破骨細(xì)胞的形成而減少糖尿病誘發(fā)的骨量丟失。芒柄花素能夠抑制原始骨髓單核-巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞增殖和分化,并下調(diào)破骨細(xì)胞骨吸收功能相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)[14]。JING Z 等[15]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山柰酚可以通過mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)成骨的生成。

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得出，AKT1、JUN、TNF-α、IL-6、VEGFA、MMP-9 及IL-1B 等是骨松寶顆粒治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，IL-1B 可以刺激破骨細(xì)胞前體向成熟破骨細(xì)胞的增殖和分化，其基因變異與骨質(zhì)疏松易感性密切相關(guān)[16]。VEGFA 即血管內(nèi)皮生長因子A，可以強(qiáng)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性及抑制破骨細(xì)胞活性，從而提高骨密度[17]。IL-6、TNF-α 作為炎癥因子能夠參與骨吸收，并促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成與分化[18]。MMP-9 參與骨骼的發(fā)育及重塑，在破骨細(xì)胞分化期間MMP-9 表達(dá)增高，刺激骨吸收[19]。AKT1 作為PI3K-AKT 信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，可以參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞協(xié)調(diào)的骨重建過程[20]。刺激JUN 表達(dá)可以增加骨祖細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)其不斷增殖分化為成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨生長和愈合[21]。

KEGG 通路分析顯示藥物作用靶點(diǎn)主要富集于MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT、IL-17 及FoxO 等信號(hào)通路。ZHI X 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MAPK通路的磷酸化，可以降低CTR、MMP-9 和TRAP 的表達(dá)水平，從而抑制破骨細(xì)胞形成。YIN Z 等[23]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-kappa B 通路，可以有效抑制破骨細(xì)胞成熟和骨吸收，保護(hù)骨小梁的結(jié)構(gòu)。FOXOs 能調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能及其細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而控制骨量及影響骨骼發(fā)育[24]。JAK/STAT 通路可以通過IRF1 基因調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的成熟和分化，參與機(jī)體的骨代謝過程[25]。IL-17 在多種炎癥細(xì)胞中表達(dá)，可以通過增加RANKL 的分泌起到刺激破骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)骨量丟失的作用[26]。

4 結(jié)論

骨松寶顆粒中山柰酚、槲皮素、木犀草素、脫水淫羊藿素等潛在活性成分，通過MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT 及FoxO 等關(guān)鍵信號(hào)通路，分別與AKT1、JUN、TNF、IL-6、VEGFA、MMP9 及IL-1B 等 核 心靶點(diǎn)以氫鍵方式結(jié)合，協(xié)同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的成熟和分化，刺激骨量形成，從而發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用。分子對(duì)接結(jié)果提示關(guān)鍵藥效成分與關(guān)鍵靶蛋白均顯示較好的結(jié)合能力，未來可進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以期為骨松寶顆粒的開發(fā)及應(yīng)用提供新的啟示。