李元超 王剛,2 王磊 吳瑋,2

1 戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻喉科(北京 100101)； 2 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境感官應(yīng)激與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸(ribbon synapse，RS)是內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell，IHC)與Ⅰ型螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGNs)形成的突觸，作為聽覺傳入通路中的第一個突觸，負(fù)責(zé)完成聲信號的機(jī)械-電換能過程[1]，是聽覺通路的重要組成部分。在噪聲暴露[2]、老齡化[3]、使用耳毒性藥物[4]等情況下，RS會發(fā)生病理性改變引發(fā)聽覺障礙。遺傳因素在耳聾發(fā)生中的作用更加重要，每1 000個新生兒中就有一個患先天性聾，其中60%以上是由遺傳因素導(dǎo)致[5]。遺傳物質(zhì)改變造成RS缺陷致聾的情況被稱為聽突觸病(auditory synaptopathy)[6，7]，屬于聽神經(jīng)病的一種，致病基因可干擾突觸小泡裝載、遞質(zhì)釋放，影響突觸前膜離子通道和突觸后膜受體的正常功能，并致其他結(jié)構(gòu)損傷。針對這類致病基因的研究目前主要來自家系分析及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物模型，本文就引起RS缺陷相關(guān)基因及其編碼蛋白功能進(jìn)行綜述。

1 內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的結(jié)構(gòu)與功能

耳蝸外毛細(xì)胞(outer hair cell, OHC)負(fù)責(zé)聲音的機(jī)械放大過程，內(nèi)毛細(xì)胞負(fù)責(zé)探測聲信號并將其轉(zhuǎn)換為聽神經(jīng)纖維中的一系列動作電位，進(jìn)而傳輸?shù)酱竽X。內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸是IHC基部與SGNs之間形成的突觸，與一般突觸不同的是，其突觸前膜活化區(qū)內(nèi)錨定有帶狀電子致密物——ribbon小體，含神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamate, Glu)的突觸囊泡大量附著于ribbon小體之上。當(dāng)受到聲信號刺激時，毛細(xì)胞纖毛發(fā)生機(jī)械擺動，隨之轉(zhuǎn)化為電信號使IHC細(xì)胞膜發(fā)生去極化，激活突觸前膜L型電壓門控鈣離子通道CaV1.3，Ca2+內(nèi)流觸發(fā)Glu的釋放，激活突觸后膜上由GluR2/3和GluR4亞基組成的AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受體，進(jìn)而成功將聲信號從IHC傳入中樞，產(chǎn)生聽覺[8]。因此，當(dāng)編碼突觸相關(guān)蛋白的基因改變導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞的興奮無法向聽神經(jīng)傳導(dǎo)時，會造成一定程度的聽力損失，表現(xiàn)為：耳聲發(fā)射(otoacoustic emission, OAE)和耳蝸微音器電位(cochlear microphonic potential, CM)可以引出，聽覺中樞功能亦正常，但聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)異常，如：ABR閾值升高，波Ⅰ振幅下降和潛伏期延長[9]。

2 聽突觸病相關(guān)基因及編碼蛋白功能(表1)

表1 聽突觸病相關(guān)基因類別及編碼蛋白功能

早期對聽突觸病缺陷基因的關(guān)注主要始于一些耳聾家系，后來為了深入研究其發(fā)病機(jī)制，一些學(xué)者通過構(gòu)建基因敲除動物模型來對疾病進(jìn)行還原，現(xiàn)在有一些學(xué)者還嘗試直接構(gòu)建潛在致病基因敲除動物模型進(jìn)行探索；一系列的研究表明，在一個功能正常的內(nèi)毛細(xì)胞RS中，支架蛋白、突觸間聯(lián)系蛋白、突觸囊泡裝載及釋放相關(guān)蛋白、谷氨酸受體等都需要及時、準(zhǔn)確地裝配，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯都會造成聽功能的損失[10]。

2.1骨架相關(guān)蛋白及相關(guān)基因 Ribeye、Bassoon、Piccolo均是構(gòu)成RS前膜ribbon小體的支架蛋白[10]，其對應(yīng)基因分別為CTBP2、BSN、PCLO，其突變或缺失將造成RS成熟障礙或結(jié)構(gòu)異常。Ribeye在突觸前Cav1.3通道和ribbon小體正確定位、維持與SGNs聯(lián)系中發(fā)揮重要作用；起初Sheets等[11]在CTBP2基因敲除的斑馬魚模型中觀察到傳入神經(jīng)元中由刺激誘發(fā)的動作電位減少、突觸前Cav1.3通道丟失的現(xiàn)象；近來Lv等[12]又證明Ribeye蛋白是Cav1.3通道和ribbon小體正確定位所必需的；此外，Becker[9]、Jean[13]的兩項(xiàng)獨(dú)立研究均發(fā)現(xiàn)CTBP2基因缺失小鼠毛細(xì)胞的胞吐功能減弱，表現(xiàn)為中度聽力損失。Piccolo和Bassoon是突觸前活性區(qū)(the active zones, AZs)中最大的兩個細(xì)胞支架蛋白，參與調(diào)控AZs的神經(jīng)遞質(zhì)釋放；Pic-colo在突觸前纖維型肌動蛋白(F-actin，具有調(diào)節(jié)Cav1.3通道相關(guān)的胞吐作用的功能)的動態(tài)組裝以及突觸前蛋白的穩(wěn)定中扮演重要角色[10]。Butola等[14]研究發(fā)現(xiàn)PCLO基因缺陷的RS誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic currents, eEPSC)幅度降低，AZs突觸囊泡減少是由于突觸囊泡易釋放池(readily releasable pool, RRP)減少，證實(shí)了Piccolo在AZs囊泡補(bǔ)充中的重要作用。Bassoon也有促進(jìn)囊泡補(bǔ)充的作用，F(xiàn)rank等[15]發(fā)現(xiàn)BSN基因缺陷會導(dǎo)致突觸前ribbon小體和相應(yīng)突觸后密度的減少，表現(xiàn)為功能性釋放位點(diǎn)數(shù)量減少，囊泡RRP補(bǔ)充受到影響；聽力測試為典型的ABR閾值升高和波Ⅰ振幅顯著降低，聽神經(jīng)纖維放電率下降[16]。

SMAD4基因是一個明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因和抑癌基因，其編碼的Smad4在組織再生、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Yang等[17]首先發(fā)現(xiàn)SMAD4也是哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育和正常聽覺功能所必需的。Liu等[18]利用同種基因敲除小鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這類小鼠的OHC和突觸后SGNs形態(tài)接近正常，但突觸前后主要結(jié)構(gòu)蛋白幾乎完全消失，聽功能檢查結(jié)果符合聽突觸病的特點(diǎn)，且電極刺激聽神經(jīng)時ABR部分恢復(fù)。這些結(jié)果表明，SMAD4缺陷會導(dǎo)致RS主要結(jié)構(gòu)蛋白的廣泛缺失而致聽突觸病,提示其他具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的基因也可能成為聽突觸病的致病基因，這類基因一旦發(fā)生突變將造成廣泛損失，嚴(yán)重者突觸結(jié)構(gòu)完全破壞。

2.2維持突觸前、后細(xì)胞聯(lián)系相關(guān)基因及蛋白 細(xì)胞粘附分子具有建立和維持突觸前、后細(xì)胞間聯(lián)系的作用。NPTN基因編碼兩種突觸富集蛋白亞型——neuroplastin-55(Np55)和neuroplastin-65(Np65)是調(diào)節(jié)包括突觸的發(fā)生、維持和可塑性在內(nèi)多個過程的跨膜糖蛋白；其中Np65在耳蝸內(nèi)定位于IHCs的突觸前區(qū)域。小鼠Np65的缺失會導(dǎo)致早發(fā)性感音神經(jīng)性聾，其機(jī)制為RS正常發(fā)生受阻，成對存在的突觸前ribbon小體和突觸后傳入終末明顯減少，囊泡釋放率下降，胞吐功能減弱[19]。

神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neuronal cell adhesion molecule，NRCAM)可能在帶狀突觸成熟過程中發(fā)揮作用。Harley等[20]發(fā)現(xiàn)，NRCAM基因敲除的小鼠在出生后早期，不成熟的ribbon小體明顯增多，但隨著年齡增長RS趨向于成熟、正常；因此NRCAM的缺失可能導(dǎo)致RS發(fā)育遲緩、聽功能成熟滯后。由此可見,不同基因的致病作用不盡相同，基因檢測對評估RS的損傷程度及預(yù)后有重要作用。

2.3突觸小泡谷氨酸裝載相關(guān)基因及蛋白 SLC17A8基因編碼囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(vesicular glutamate transporter3,VGLUT3)，參與Glu的釋放活動，負(fù)責(zé)將Glu裝載到突觸小泡內(nèi)以便釋放[21]。VGLUT3敲除小鼠的RS中沒有Glu的釋放活動，表現(xiàn)為OAE正常、ABR缺失[22]；其發(fā)育過程中表現(xiàn)出SGNs數(shù)量以及向腦干的投射進(jìn)行性減少，可能是由于SGNs失去了Glu的營養(yǎng)作用所致[23]。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin mediated endocytosis, CME)途徑是突觸區(qū)域囊泡回收的主要方式，銜接蛋白AP-2(adaptin-2)是參與調(diào)控CME的關(guān)鍵蛋白，由α、β、μ2、σ2四個亞基組成[24]，有研究發(fā)現(xiàn)AP-2 mu的缺失造成聽力損傷的原因是RS囊泡釋放部位的回收及再裝載功能受損[25]。

2.4突觸小泡釋放相關(guān)基因及蛋白 OTOF基因發(fā)現(xiàn)于一個非綜合征型常染色體隱性遺傳性聾家系中，它編碼的蛋白o(hù)toferlin通過C2結(jié)構(gòu)域與Ca2+結(jié)合參與膜融合事件，在RS中作為突觸囊泡釋放與RRP補(bǔ)充的Ca2+感受器，使囊泡膜與突觸前膜融合發(fā)生胞吐[26]。OTOF基因缺失小鼠聽功能嚴(yán)重受損，但內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、RS結(jié)構(gòu)和Ca2+電流均正常，發(fā)病機(jī)制為RS胞吐功能缺陷[27,28]。近來Manchanda等[29]學(xué)者敲除斑馬魚OTOF基因后其突觸前ribbon小體錨定缺陷以及毛細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)Ca2+水平升高。小鼠與斑馬魚表現(xiàn)出不同的RS病理特點(diǎn)也提示otoferlin蛋白在不同物種中的功能差異。

GET1(WRB)基因編碼的蛋白介導(dǎo)otoferlin通過跨膜識別復(fù)合物途徑插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這一過程是毛細(xì)胞胞吐必需的。Lin等[30]和Vogl等[31]在斑馬魚和小鼠IHCs的WRB突變體中發(fā)現(xiàn)IHC中otoferlin水平下降，RS中囊泡補(bǔ)充受損導(dǎo)致錨定于ribbon小體的囊泡變少，而Ca2+內(nèi)流、Ca2+內(nèi)流-胞吐耦合和囊泡融合均不受影響。

CABP2基因編碼Ca2+結(jié)合蛋白-2(calcium-binding protein 2,CABP-2)屬于與鈣調(diào)蛋白相關(guān)的鈣離子結(jié)合蛋白家族，正常情況下在RS中CABP-2能抑制Cav1.3通道失活，確保聲音信息準(zhǔn)確及時的傳遞[32]。CABP2基因突變會導(dǎo)致人類常染色體隱性耳聾DFNB93[33]，在基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)其耳聾機(jī)制為：CABP-2缺失導(dǎo)致原本幾乎不失活的 Cav1.3通道失活程度提高[34]，聲音信息在突觸處傳遞受阻。近期Ortner等[35]發(fā)現(xiàn)RIM結(jié)合蛋白-2 (RIM-binding protein 2,RBP2) 具有類似的抑制Cav1.3通道失活的效應(yīng)。

CACNA1D基因編碼Cav1.3通道，在耳蝸中介導(dǎo)RS胞吐過程中的Ca2+內(nèi)流、內(nèi)毛細(xì)胞Ca2+動作電位的產(chǎn)生和一些Ca2+依賴基因表達(dá)過程，當(dāng)人體發(fā)生系統(tǒng)性Cav1.3功能異常時表現(xiàn)為綜合征型聾[36]。Brandt等[37]研究Cav1.3通道缺失小鼠的IHCs，可見除突觸傳遞功能缺陷外，還存在IHC傳入樹突結(jié)構(gòu)的成熟障礙和退化；表明CaV1.3通道對耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的發(fā)育和突觸前活動均是必不可少的。此外，Eckrich等[38]還發(fā)現(xiàn)耳蝸Cav1.3通道的特異性缺失會抑制小鼠內(nèi)毛細(xì)胞分化，導(dǎo)致K+通道成熟障礙。Sheets等[39]研究發(fā)現(xiàn)Cav1.3通道缺失或急性阻斷導(dǎo)致ribbon小體變大，而通道激活會導(dǎo)致相反結(jié)果，表明Cav1.3通道還可以通過控制Ca2+的內(nèi)流調(diào)節(jié)突觸前膜ribbon小體的大小[39]。

DIAPH3基因編碼透明同系物3(diaphanous homolog 3, DIAPH3)在細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，DIAPH3基因也是常染色體顯性遺傳非綜合征型聽神經(jīng)病AUNA1的致病基因，其過度表達(dá)可引發(fā)典型聽神經(jīng)病的聽覺障礙[40]。Schoen等[41]進(jìn)一步構(gòu)建DIAPH3基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型重現(xiàn)人AUNA1耳聾，發(fā)現(xiàn)突觸前ribbon小體的丟失所致胞吐缺陷是產(chǎn)生這種聽覺障礙的重要原因。

2.5谷氨酸受體相關(guān)基因及蛋白 CLRN1基因編碼的產(chǎn)物Clarin-1在耳蝸內(nèi)定位在毛細(xì)胞的頂部和基部，參與受體轉(zhuǎn)運(yùn)、信號相關(guān)分子聚集和支架功能等[42]。研究表明Clarin-1可能參與囊泡運(yùn)輸和突觸的發(fā)育及維持，CLRN1基因敲除小鼠中觀察到突觸后AMPA受體的分布異常廣泛，同時內(nèi)毛細(xì)胞膜片鉗記錄顯示胞吐缺陷、突觸F-actin和Cav1.3通道紊亂[43]。單純谷氨酸受體缺陷致聾的研究鮮有報道，目前對AMPA受體與聽力損失相關(guān)的研究主要集中于噪聲、缺血、缺氧等，這些因素引起Glu釋放過量造成突觸后SGNs興奮性損傷——谷氨酸興奮性毒性[44]。雖然可以推測AMPA受體遺傳缺陷對聽功能的負(fù)面效應(yīng)，但是其具體機(jī)制、表現(xiàn)還需要進(jìn)一步的研究來明確。

3 總結(jié)與展望

近年來一系列聽突觸病相關(guān)基因的新發(fā)現(xiàn)從分子水平揭示了其病理機(jī)制，成為聽突觸病診治的重要的分子生物學(xué)依據(jù)。綜合目前對聽突觸病致病基因的研究來看，引發(fā)RS功能異常的基因缺陷種類多，與突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)Glu的釋放障礙相關(guān)的占大部分。聽突觸病中單一位點(diǎn)突變往往帶來一系列繼發(fā)性RS結(jié)構(gòu)或功能損傷，例如突觸小泡的錨定障礙勢必會引起Glu的釋放減少，突觸前膜Glu的釋放障礙也會引起繼發(fā)性的SGNs退行性改變或其他功能異常。不同的基因缺陷造成的后果可能是相似的，例如CACNA1D基因和CABP2基因突變導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞Ca2+動作電位產(chǎn)生障礙，造成突觸前膜胞吐缺陷。依據(jù)所致?lián)p傷的具體結(jié)構(gòu)、部位不同，對聽突觸病變不同致病基因進(jìn)行分類總結(jié)，便于分析致病機(jī)理。