王曉雨 田潤剛,2 楊 國 韓雪源,2

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2. 紹興市黃酒質(zhì)量安全與清潔生產(chǎn)重點實驗室；紹興黃酒釀造技術(shù)傳承與創(chuàng)新平臺，浙江 紹興 312000)

引言

黃酒是中國傳統(tǒng)酒類飲品，在世界三大釀造酒中占有重要的一席.其釀酒技術(shù)獨樹一幟，是東方釀造界的典型代表.黃酒中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，享有“液體蛋糕”的美譽，并且具有一定的保健功能[1].黃酒中富含氨基酸、糖類、維生素以

及硒、鋅、鐵、銅等多種人體必需的微量元素.此外，黃酒中特有的酚類物質(zhì)、活性肽及功能性低聚糖等均有不同程度的保健作用，因此黃酒在很大程度上滿足了人們對酒精飲品營養(yǎng)價值及養(yǎng)生保健方面的需求[2].

然而，黃酒中依然存在一些具有健康隱患的危險物質(zhì).例如，高級醇是黃酒產(chǎn)生香氣物質(zhì)和適宜口感的主要成分，但過多的高級醇不僅影響黃酒的口感和品質(zhì)，而且對人體會產(chǎn)生一定的毒害作用[3].此外，氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，簡稱EC)是一種已知的致癌物和誘變劑.與其他釀造酒相比，黃酒中的EC含量相對較高[4-5].同時，在后期的成品黃酒中，尿素將與黃酒中的乙醇發(fā)生緩慢反應(yīng)產(chǎn)生EC，因此尿素也是黃酒安全生產(chǎn)的隱患和危險物質(zhì)之一.甲醇既是酒的芳香成分，也是有害成分，具有較強毒性，而且容易在體內(nèi)大量積累，難以及時排出，對身體損害大，尤其是對人體血管、神經(jīng)系統(tǒng)的麻痹作用較大[6].

Zhou等[7]研究表明，竹葉提取物對黃酒釀造體系中EC含量具有抑制效果，并且推測竹葉酚類物質(zhì)在其中發(fā)揮重要作用.酚類物質(zhì)富含于覆盆子提取物、火棘提取物、竹葉提取物和沙棘提取物中，是提取物的主要成分.因此，本研究嘗試將以上四種植物提取物分別添加于黃酒釀造過程中，通過對釀得酒樣的EC含量、甲醇含量、尿素含量和高級醇含量以及植物提取物的總酚含量進行比較分析，探索不同植物提取物的添加對黃酒中有害物質(zhì)含量的影響.

1 材料與方法

1.1 黃酒發(fā)酵

將1.5 kg熟糯米、1.25 L蒸餾水、1.5 g黃酒酵母、 225 g麥曲和0.25 g乳酸鏈球菌素加入5.0 L的發(fā)酵容器中，環(huán)境溫度為28 ℃，發(fā)酵4～5天.之后設(shè)置溫度為18 ℃，進行后發(fā)酵.在發(fā)酵第三天分別加入濃度為500 mg/L的覆盆子提取物、500 mg/L火棘提取物、500 mg/L竹葉提取物和500 mg/L沙棘提取物.以未添加植物提取物的發(fā)酵組為對照組.發(fā)酵期間，每2天用Erma手持折射儀(SDR-500)測定白利糖度(°Brix).待后發(fā)酵完成后，將酒樣進行壓榨、澄清.

1.2 酒精度測定

采用蒸餾法測定酒精含量[8].量取100 mL的酒液加入 Gibertini DEEPV(Super DEE，GIBERTINI，意大利)快速蒸餾儀器中，蒸餾后，使用Gibertini Densimat/Alcomat2(AlcoMat-2，GIBERTINI，意大利)酒精度測定儀，測定酒精含量.

1.3 氨基甲酸乙酯含量測定

參考譚文淵等[9]，采用高效液相色譜(HPLC)法測定黃酒中的氨基甲酸乙酯含量.并用不同濃度EC標準溶液制作峰面積-濃度標準曲線，進一步對酒樣中EC含量進行相對定量.

詳細分析參數(shù)如下：流動相， 乙腈：水=80∶20(體積比)； 流速0.8 mL/min； 檢測波長215 nm；柱溫20 ℃；進樣量20 μL.用量筒準確量取30 mL待測酒樣于球型滴液漏斗中，用3 mL正己烷溶液活化氨基柱，調(diào)節(jié)漏斗開關(guān)，緩慢將30 mL酒樣通過活化好的氨基柱，再將5 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，體積比)溶液淋洗萃取柱后，用8 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，體積比)溶液洗脫萃取柱，將淋洗液和洗脫液合并裝入圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，用乙腈定容至2 mL，待HPLC分析.

1.4 高級醇含量測定

通過氣相色譜儀對酒樣中的高級醇含量進行分析[10]，以各種高級醇標準液為參照，通過制作峰面積-濃度標準曲線，進一步對酒樣中各高級醇含量進行相對定量.詳細分析參數(shù)如下：色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30.0 mm×0.25 mm ID，0.25 μm)；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；線速度：24.9 cm/sec；色譜柱流量：0.94 mL/min；總流量13.4 mL/min；氣化室溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃.升溫過程：初始溫度50 ℃，恒溫1 min后以5 ℃/min升溫至90 ℃，再恒溫1 min后以15 ℃/min升溫至230 ℃，再恒溫3 min.

1.5 甲醇含量測定

采用品紅-亞硫酸法對酒樣中的甲醇含量進行測定[11].

1.6 尿素含量測定

采用二乙酰一肟方法對酒樣中的尿素含量進行測定[2].

1.7 植物提取物總酚含量測定

四種植物提取物過80目篩，分別稱取5.0 g于錐形瓶中，加入50 mL色譜級甲醇，放置于超聲提取器中提取45 min(40 ℃，350 W)，提取完成后，于4 ℃冷凍離心10 min(8 000 rpm)后取上清液，重復(fù)上述過程三次.合并提取液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，用甲醇定容至25 mL.于4 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?在整個實驗過程中注意避光操作.

采用Folin-Ciocalteu法測定植物提取物中總酚含量，以沒食子酸為標準品.準確吸取不同濃度沒食子酸標準品溶液和多酚提取液各0.1 mL于具塞試管中，依次加入7.9 mL蒸餾水，0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻后反應(yīng)5 min，加入20%(w/v)Na2CO3溶液1.5 mL，暗處反應(yīng)2 h后于765 nm處測定吸光值.總酚含量表示為mg GAE/ 100g dw (干重)[12].

1.8 統(tǒng)計分析

所有實驗進行三次生物學(xué)重復(fù).實驗結(jié)果用平均值加上或者減去標準差(±SD)表示.采用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性(Duncan檢驗)分析，在0.05水平上，用不同小寫字母表示差異顯著性.并采用SPSS 25.0軟件進行Pearson相關(guān)性分析，在0.05水平(雙尾)上，用“*”表示顯著性相關(guān).

2 結(jié)果

本研究中所釀造酒樣的乙醇含量(%(v/v))如下：對照組17.94±0.311%、覆盆子組16.25±1.103%、火棘組16.90±1.530%、竹葉組17.93±0.773%、沙棘組17.50±0.277%.覆盆子組和火棘組的酒精含量略低于其他三組.各組樣品均有較高的酒精含量，說明試驗具有較好發(fā)酵效率.

2.1 不同植物提取物對EC含量的影響

通過不同濃度EC標準液的HPLC分析如圖1(a)所示，得到峰面積與濃度標準曲線(y=38 971x-6 550，R2=0.999 4)，進一步結(jié)合樣品液相色譜EC峰面積(圖1(b)),計算得到各組酒樣中EC含量(表1).結(jié)果顯示，覆盆子組的EC含量(21.942±6.895 μg/L)最低，而竹葉組的EC含量顯著高于其他組.

(a)EC標準液液相色譜圖

表1 酒樣中EC、甲醇、尿素含量

2.2 不同植物提取物對甲醇含量的影響

對黃酒而言，釀酒原料中含有的果膠質(zhì)是甲醇生成的基礎(chǔ)，它主要集中在原料的表皮，例如米麥的表面.由表1可知，對照組甲醇含量(0.537±0.252 mg/L)最高， 而覆盆子組的甲醇含量(0.289±0.088 mg/L)最低，顯著低于對照組.

2.3 不同植物提取物對尿素含量的影響

如表1所示，與對照組相比，試驗組尿素含量均有所降低，并且覆盆子組、火棘組、竹葉組酒樣中尿素含量顯著低于對照組，其中覆盆子組尿素含量最低(21.183±2.365 mg/L).

2.4 不同植物提取物對高級醇含量的影響

黃酒中高級醇含量過高會破壞其風(fēng)味的協(xié)調(diào)性，甚至?xí)θ梭w造成危害.在本研究中，通過氣相色譜法對黃酒中的高級醇進行分析，由圖2可得各高級醇出峰時間，順序依次為：正丙醇5.208 min、異丁醇6.307 min、正丁醇7.648 min、異戊醇8.947 min、正戊醇10.020 min、苯甲醇18.045 min、苯乙醇18.343 min.與對照組相比，所有試驗組中異丁醇、苯乙醇含量均有所降低，其中火棘組異丁醇含量顯著低于其他組.火棘組和沙棘組酒樣中除正戊醇外，其他高級醇含量均低于對照組，且火棘組中異戊醇含量最低.同時，火棘組的高級醇總含量最低(表2).

圖2 高級醇標準液氣相色譜圖

表2 酒樣中的高級醇含量

2.5 相關(guān)性分析

對植物提取物的總酚含量進行測定，結(jié)果如表3所示， 其中竹葉提取物的總酚含量最高(0.410±0.013 mg GAE /100 g)，其次是覆盆子提取物(0.265±0.011 mg GAE /100 g).對植物提取物總酚含量與酒樣有害物質(zhì)含量進行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)性分析顯示，植物提取物的總酚含量與酒樣尿素含量呈顯著負相關(guān)性，酒精含量與EC含量呈顯著正相關(guān)性(圖3).

圖3 植物提取物總酚含量與酒樣中有害物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表3 植物提取物的總酚含量

3 討論

黃酒的釀造過程中會產(chǎn)生或引入一些不利于人體健康的物質(zhì), 如EC、 高級醇、 甲醇、 尿素等，這些有害物質(zhì)在一定程度上影響了黃酒的品質(zhì)，制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展[13].研究顯示，酚類物質(zhì)的添加有助于降低黃酒中有害物質(zhì)含量[4,14-15].植物提取物中富含大量酚類物質(zhì)，是一種高效的天然抗氧化劑，能有效預(yù)防高血脂、高血糖、心腦血管疾病、腫瘤等慢性疾病，廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[16-17].因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，嘗試在黃酒發(fā)酵過程中分別添加覆盆子提取物、火棘提取物、竹葉提取物和沙棘提取物，探索其對黃酒有害成分含量的抑制.結(jié)果表明，植物提取物對黃酒部分有害成分的產(chǎn)生具有一定抑制效果，并根據(jù)相關(guān)性分析推測植物提取物中的酚類物質(zhì)可能起到重要作用.

EC，被國際癌癥研究機構(gòu)列為可能令人類患癌的物質(zhì)，其產(chǎn)生途徑主要是氨甲?；衔?乙醇途徑，比如尿素-乙醇反應(yīng)、瓜氨酸-乙醇反應(yīng)、氨甲酰磷酸-乙醇反應(yīng).本研究表明，添加覆盆子提取物降低了黃酒中的EC含量.這與Zhou等[7]的研究結(jié)果相類似，竹葉提取物的添加降低了酒體中EC含量.周萬怡[18]研究顯示，添加沒食子酸和原兒茶酸能顯著抑制單酵母發(fā)酵黃酒中EC的形成，而添加竹葉提取物可以抑制傳統(tǒng)黃酒釀造體系中EC的形成.本研究中，竹葉提取物總酚含量最高，高于覆盆子提取物，然而覆盆子組的EC含量低于竹葉組.韓煜[19]研究表明覆盆子中所含多酚成分主要為沒食子酸.因此，推測由于竹葉和覆盆子提取物中單體酚類如GC、PC等含量不同而導(dǎo)致上述EC含量和酚類總含量趨勢的不一致.相關(guān)性分析顯示，植物提取物的總酚含量與酒樣尿素含量呈顯著負相關(guān)性.尿素是發(fā)酵酒類飲料中最主要的EC前體物，黃酒中EC有90%來源于尿素與乙醇反應(yīng)[18].據(jù)此推測植物總酚含量應(yīng)與EC含量也呈現(xiàn)負相關(guān)性，然而本研究中的相關(guān)性分析并未得到此結(jié)果，因此植物總酚含量與黃酒中EC含量的相關(guān)性有待進一步探究.

黃酒中高含量的高級醇類是引起上頭的主要因素，且黃酒中高級醇含量遠遠高于其他釀造酒[20].但是高級醇也是黃酒的主要風(fēng)味物質(zhì)，是釀造過程中不可避免的副產(chǎn)物.有研究表明，采用低產(chǎn)高級醇的酵母進行發(fā)酵，能夠降低高級醇含量[21-22].也有研究顯示，添加谷氨酸會顯著影響發(fā)酵果汁的發(fā)酵過程，對荔枝酒中高級醇生成量有明顯的抑制作用[23].在本研究中，添加火棘提取物和沙棘提取物使酒樣中的大部分高級醇含量有所降低.

黃酒是富含營養(yǎng)價值的低度飲料酒，符合現(xiàn)代人由高度酒向低度、營養(yǎng)型酒轉(zhuǎn)化的消費趨勢.因此，對黃酒中具有安全風(fēng)險的物質(zhì)進行研究并降低其含量，對提升黃酒的品質(zhì)具有重要意義.

4 結(jié)論

本研究通過在發(fā)酵過程中分別添加覆盆子、火棘、竹葉和沙棘植物提取物，探究植物提取物對黃酒中有害成分含量的影響.以添加的不同植物提取物作為影響因素，以酒樣中EC含量、甲醇含量、尿素含量和高級醇含量為測量指標，進行單因素試驗.結(jié)果表明添加覆盆子提取物對酒樣中EC、甲醇和尿素含量具有顯著抑制作用；其次，火棘提取物和沙棘提取物的添加對酒樣中高級醇的含量具有較好的降低效果.關(guān)于以上植物提取物的添加對黃酒中有害物質(zhì)含量影響的原理，有待于進一步研究.