王婷婷,戴仕林,劉潺潺,蔣征,吳啟南,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023;3.中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,江蘇 南京 210023)

形態(tài)特征無(wú)明顯差異的同種植物由于所含代謝物組成或含量的差異可被區(qū)分為不同的化學(xué)型,化學(xué)型是植物種內(nèi)變異之一,體現(xiàn)了種內(nèi)生物多樣性[1]?；瘜W(xué)型一般是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用形成的,并且在藥用植物中普遍存在。不同產(chǎn)地或不同品種間藥用植物所含代謝物存在一定差異,進(jìn)而對(duì)其藥效產(chǎn)生影響。因此,化學(xué)型形成機(jī)制的研究對(duì)藥材道地性的闡明、藥材質(zhì)量控制具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.為一年生草本,干燥的全草入藥為青蒿藥材,有濃郁香氣,是提取抗瘧特效藥青蒿素的原料。黃花蒿含有豐富的揮發(fā)性成分,以單萜、倍半萜為主,現(xiàn)有研究表明其具有良好的抗菌[2-5]、抗氧化[6-8]、解熱[5]等作用。黃花蒿作為一種高抗逆性物種,分布廣泛[9],不同地區(qū)的黃花蒿揮發(fā)性成分的組成和含量均差異明顯,藥理活性也各有側(cè)重。

江蘇和河南均為青蒿藥材的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)[10],并且江蘇盱眙產(chǎn)青蒿藥材是品牌中成藥的原料藥之一[11],兩地藥材揮發(fā)性成分研究對(duì)黃花蒿藥用資源的利用具有重要意義。本研究通過(guò)頂空-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(HS-GC-QQQ-MS/MS)分析2個(gè)產(chǎn)地黃花蒿的揮發(fā)性成分,超快速高效液相色譜-三重四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)非靶向分析不同化學(xué)型差異代謝物,并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析相關(guān)萜類成分基因表達(dá),以期為黃花蒿化學(xué)型形成機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HS-GC-QQQ-MS/MS(7697A-7000C)(美國(guó)Agilent公司);SIL-20A XR超快速液相色譜儀(日本Shimadzu公司);Triple TOFTM5600 System-MS/MS高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司);萬(wàn)分之一電子分析天平(日本Shimadzu公司);SAGA-TY純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司);冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman coulter公司);冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司);-80 ℃低溫保存冰箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)。

1.2 試藥

江蘇產(chǎn)黃花蒿種子由江蘇盱眙青蒿藥材基地提供(北緯33.0°,東經(jīng)118.48°),樣品編號(hào):JXAa;河南產(chǎn)黃花蒿種子由實(shí)驗(yàn)室在河南中牟縣收集(北緯34.44°,東經(jīng)113.94°),樣品編號(hào):HZAa;家庭園藝營(yíng)養(yǎng)土(美樂(lè)棵);甲醇(美國(guó)Merck公司);乙腈(美國(guó)Merck公司);乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 植物種植和取樣

將兩地黃花蒿種子撒于裝土的方形盆(11 cm×11 cm×9.5 cm)中，在溫度(25±2)℃,濕度60%～70%的條件下萌發(fā),長(zhǎng)至1個(gè)月后,將幼苗移栽至方形盆(10 cm×10 cm×14 cm),每盆1株,待生長(zhǎng)近5個(gè)月時(shí),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為菊科蒿屬植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.。JXAa和HZAa各選3株,取其葉片,低溫冷藏，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和化學(xué)成分分析。

2.2 樣品制備

2.2.1 HS-GC-QQQ-MS/MS樣品制備 分別取JXAa、HZAa黃花蒿鮮葉各200 mg,置于規(guī)格為25 mL配有聚四氟乙烯膠墊的頂空瓶中,壓蓋密封。

2.2.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS樣品制備 分別取JXAa、HZAa黃花蒿鮮葉,冷凍干燥2 d,粉碎,過(guò)4號(hào)篩,稱取100 mg粉末,溶于0.6 mL 70%甲醇提取液,置于4 ℃條件下的搖床上振搖過(guò)夜。10 000 r·min-1冷凍離心10 min,吸取上清,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,置于進(jìn)樣瓶。

2.3 HS-GC-QQQ-MS/MS測(cè)定條件

2.3.1 頂空平衡條件 加熱箱65 ℃;樣品平衡40 min;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間0.5 min;GC循環(huán)52 min;在加熱箱中震蕩樣品瓶(71 min-1)。

2.3.2 色譜條件 色譜柱:Agilent 19091S-433UI HP-5MS UItra Inert(30 mm×250 μm，0.25 μm);流速:1.0 mL·min-1;升溫程序:初始溫度50 ℃,保持2 min,以4 ℃·min-1的速率升溫至110 ℃,以8 ℃·min-1的速率升溫至130 ℃,以3 ℃·min-1的速率升溫至180 ℃,以10 ℃·min-1的速率升溫至240 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1.0 μL；分流比：30∶1[11]。

2.3.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度:230 ℃;電子轟擊能量:70 eV;離子掃描范圍:50～450 aum;MS1四極桿溫度:150 ℃。

2.4 UFLC-Triple TOF-MS/MS測(cè)定條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Elipse Plus C18Rapid Resolution HD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)。流動(dòng)相:A相為超純水(加入0.04%乙酸),B相為乙睛(加入0.04%乙酸)。洗脫梯度:0～10.00 min,5%～95%B;10.00～11.00 min,95%B;11.00～12.00 min,95%～5%B;12.00～14.10 min,5%B。流速0.35 mL·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量4 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù);質(zhì)量掃描范圍m/z:50～1 500;離子源溫度(TEM):550 ℃;簾氣(CUR)流速:40 L·min-1,霧化氣(GS1)流速:60 L·min-1;輔助氣(GS2)流速：60 L·min-1;噴霧電壓(IS)正離子模式5 500 V,負(fù)離子模式-4 500 V;去簇電壓(DP)正離子模式100 V,負(fù)離子模式-100 V。

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分別取JXAa、HZAa樣品各3份作為生物學(xué)重復(fù),委托武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司高通量實(shí)驗(yàn)室使用DNBSEQ平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

2.6 數(shù)據(jù)處理

2.6.1 HS-GC-QQQ-MS/MS數(shù)據(jù)處理 使用Agilent MassHunter Qualitative analysis B.07.00軟件進(jìn)行分析,NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)鑒定化合物。

2.6.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS數(shù)據(jù)處理 將原始數(shù)據(jù)通過(guò)Analysis Base File Converter轉(zhuǎn)化為abf格式文件并導(dǎo)入MS-DIAL 4.24[12],設(shè)置一級(jí)質(zhì)譜偏差為0.01 Da,二級(jí)質(zhì)譜偏差為0.025 Da,最小峰高為1 000,進(jìn)行峰提取和峰識(shí)別;保留時(shí)間偏差為0.05 min,進(jìn)行峰對(duì)齊,最終獲得由峰保留時(shí)間、峰質(zhì)荷比、峰面積等構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣。將處理好的數(shù)據(jù)以CSV格式保存并導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0[13],在Statistical Analysis模塊下進(jìn)行峰面積歸一化及對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,將數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)以及正交偏最小二乘分析(OPLS-DA),篩選差異數(shù)據(jù)。Functional Analysis模塊下導(dǎo)入篩選后的差異數(shù)據(jù),通過(guò)Plants項(xiàng)下Arabidopsisthaliana(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物鑒定。將鑒定好的差異代謝物導(dǎo)入Pathway analysis模塊進(jìn)行代謝物通路分析,選擇散點(diǎn)圖作為數(shù)據(jù)可視化方法,通路富集方法采用超幾何分布檢驗(yàn),拓?fù)浞治鲞x擇Relative-betweeness centrality,數(shù)據(jù)庫(kù)為Arabidopsisthaliana(KEGG),并且選擇數(shù)據(jù)庫(kù)中所有化合物作為通路富集分析的參考。

2.6.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理 在測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)中過(guò)濾低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基(N)含量過(guò)高的數(shù)據(jù),然后將過(guò)濾后數(shù)據(jù)(Clean reads)比對(duì)到參考基因組(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/plant/Artemisia_annua/latest_assembly_versions/GCA_003112345.1_ASM311234v1/),檢測(cè)不同樣品之間的差異表達(dá)基因,結(jié)合GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異基因功能注釋,隨后對(duì)已注釋的差異基因進(jìn)行GO注釋分析和KEGG代謝通路分析。使用TBtools軟件[14],以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)庫(kù),用黃花蒿基因組中冰片脫氫酶和黃花蒿醇脫氫酶2(ADH2)基因序列進(jìn)行blast比對(duì),尋找轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中編碼冰片脫氫酶和ADH2候選基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 HS-GC-QQQ-MS/MS結(jié)果分析

2組樣品共鑒定出22種化學(xué)成分,相同化合物12種,根據(jù)主成分相對(duì)含量占比,確定JXAa為蒿酮型、HZAa為樟腦型,見(jiàn)圖1、表1。蒿酮型共鑒定出15種成分,其中萜類11種,相對(duì)含量最高的是蒿酮(51.28%),其次是桉葉油醇(12.37%)。樟腦型共鑒定出19種成分,其中萜類15種,相對(duì)含量最高的是樟腦(30.7%),其次是莰烯(21.38%)。2組樣品除揮發(fā)性成分樟腦以外，相同化合物的相對(duì)含量，蒿酮型占比為44.91%，樟腦型占比為58.81%。

注:A.JXAa;B.HZAa

表1 黃花蒿揮發(fā)性成分(n=4)

3.2 UFLC-Triple TOF-MS/MS結(jié)果分析

2種化學(xué)型在正、負(fù)離子模式下UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰圖,見(jiàn)圖2～3。2種化學(xué)型黃花蒿在PCA、OPLS-DA圖中均分離明顯,OPLS-DA模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)正、負(fù)離子模式下Q2回歸線與Y軸相交低于零,負(fù)離子模式下R2綠點(diǎn)基本上低于最右R2綠點(diǎn),即原始點(diǎn),說(shuō)明模型穩(wěn)定性較好,見(jiàn)圖4～5。

注:A.正離子模式;B.負(fù)離子模式

注:A.正離子模式;B.負(fù)離子模式

圖4 正離子模式下2種化學(xué)型黃花蒿PCA圖(A)、OPLS-DA得分圖(B)、OPLS-DA模型驗(yàn)證圖(C)

VIP可以衡量代謝物對(duì)OPLS-DA模型的重要程度,通常作為篩選差異代謝物的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)以VIP≥1和P<0.05作為篩選差異代謝物標(biāo)準(zhǔn)。在正、負(fù)離子模式下共篩選出253個(gè)差異代謝物,其中蒿酮型上調(diào)的差異代謝物有182種,樟腦型上調(diào)的差異代謝物有71種。

在代謝通路圖中,圓圈代表代謝通路,圓圈大小表示樣品中所含該通路的代謝物對(duì)代謝通路的影響,圓圈顏色表示顯著性(P值)大小,P值越大,圓圈顏色越紅。蒿酮型黃花蒿排名靠前的萜類代謝通路中有揮發(fā)性成分相關(guān)的倍半萜、三萜生物合成,見(jiàn)圖6A;樟腦型黃花蒿排名靠前的萜類代謝通路主要是二萜生物合成,見(jiàn)圖6B,其中二萜生物合成代謝通路上調(diào)化合物主要是赤霉素合成通路上的物質(zhì)ent-7α-Hydroxykaur-16-en-19-oic acid、Kaur-16-en-18-ol、Kaur-16-en-18-al、香葉基芳樟醇[(E,E)-Geranyllinalool]等,見(jiàn)表2。

表2 樟腦型黃花蒿二萜通路上調(diào)差異代謝物

圖5 負(fù)離子模式下2種化學(xué)型黃花蒿PCA圖(A)、OPLS-DA得分圖(B)、OPLS-DA模型驗(yàn)證圖(C)

圖6 蒿酮型(A)和樟腦型(B)黃花蒿上調(diào)代謝物通路分析

3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)樣品比對(duì)基因組[15]的平均比對(duì)率為81.35%,共檢測(cè)到表達(dá)的基因數(shù)為46 413。基于負(fù)二項(xiàng)分布原理,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Love等[16]描述的方法進(jìn)行差異基因檢測(cè),共檢測(cè)到10 023個(gè)差異基因,用火山圖來(lái)表示差異基因的分布,見(jiàn)圖7A,發(fā)現(xiàn)蒿酮型黃花蒿上調(diào)差異基因數(shù)為5 136,樟腦型黃花蒿上調(diào)差異基因數(shù)為4 887。

3.3.1 GO注釋分析 GO共有三大功能類：生物過(guò)程(Biological process)、細(xì)胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。生物過(guò)程大類共21個(gè)亞類,其中占比最高的亞類是細(xì)胞過(guò)程(Cellular process),注釋數(shù)量為3 650,其次是代謝過(guò)程(Metabolic process),注釋數(shù)量為29 922。細(xì)胞組分大類共3個(gè)亞類,其中細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體(Cellular anatomical entity)和細(xì)胞內(nèi)(Intracellular)占比最高,注釋數(shù)量分別為5 659和3 100,其次是含蛋白質(zhì)復(fù)合物(Protein-containing complex),注釋數(shù)量為967。分子功能大類共16個(gè)亞類,其中占比最高的是2個(gè)亞類是催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合(Binding),注釋數(shù)量分別為4 562和4 452,見(jiàn)圖7B。

圖7 2種化學(xué)型黃花蒿差異基因火山圖(A)和差異基因GO分類圖(B)

3.3.2 萜類基因分析 根據(jù)HS-GC-QQQ-MS/MS數(shù)據(jù),2種源黃花蒿的揮發(fā)性成分中單萜組分差異明顯,據(jù)此分為2種化學(xué)型。UFLC-Triple TOF-MS/MS數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分相關(guān)的萜類差異代謝物主要集中于二萜代謝通路和倍半萜、三萜代謝通路。萜類化合物的碳骨架是通過(guò)代謝中間體異戊烯二磷酸和二甲烯基焦磷酸縮合而成，二者在自然界中通過(guò)甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑生成。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中萜類骨架MEP途徑和MVA途徑共注釋到11個(gè)關(guān)鍵酶[1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶(HDR)、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPPI)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶牻牛兒基焦磷酸合酶(GPS)、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(AACT)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MK)、甲羥戊酸激酶(PMK)、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MPDC)、法尼基焦磷酸合酶(FDPS)]的23個(gè)候選基因具有顯著差異。異戊烯二磷酸和二甲烯基焦磷酸經(jīng)由GPS、GGPS催化形成單萜、二萜。其中單萜合成路徑中,1,8-桉樹(shù)腦合酶(TPS-Cin)在桉葉油醇生物合成中起到重要作用,本次測(cè)序共檢測(cè)到10個(gè)候選基因,其中9個(gè)在樟腦型中高表達(dá)。在樟腦合成路徑中發(fā)現(xiàn)2個(gè)在樟腦型黃花蒿中高表達(dá)的冰片脫氫酶候選基因,并且在蒿酮擬合成路徑[17]中發(fā)現(xiàn)3個(gè)蒿酮型黃花蒿中高表達(dá)的ADH2候選基因。赤霉素合成路徑中共注釋到6個(gè)關(guān)鍵酶[內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶(CPS)、貝殼杉烯C19氧化酶(GA3)、赤霉素雙加氧酶(GA20OX)、赤霉素3-β-雙氧酶(GA3OX)、香葉基芳樟醇合酶(TPS04)、三甲基十三烷四烯合酶(CYP82G1)]的11個(gè)候選基因在樟腦型黃花蒿中高表達(dá),見(jiàn)圖8。

注:AK-T.蒿酮型;C-T.樟腦型;DXS.1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶;HDR.4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶;IPPI.異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶;GPS.異戊烯基轉(zhuǎn)移酶牻牛兒基焦磷酸合酶;GGPS.牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶;AACT.乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶;HMGR.3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶;MK.甲羥戊酸激酶;PMK.甲羥戊酸激酶;MPDC.甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶;FDPS.法尼基焦磷酸合酶;CPS.內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶;GA3.貝殼杉烯C19氧化酶;GA20OX.赤霉素雙加氧酶;GA3OX.赤霉素3-β-雙氧酶;TPS04.香葉基芳樟醇合酶;CYP82G1.三甲基十三烷四烯合酶;ADH2.黃花蒿醇脫氫酶2;TPS-Cin.1,8-桉樹(shù)腦合酶

4 討論

同種藥用植物以化學(xué)型分型，影響分型的代謝物差異明顯，可能對(duì)其藥效產(chǎn)生影響，從而影響藥材品質(zhì)。李洪梅等[18]在探究不同化學(xué)型樟揮發(fā)油對(duì)大鼠足跖關(guān)節(jié)炎癥模型的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)異樟揮發(fā)油對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹抑制率高于腦樟和龍腦樟揮發(fā)油,腦樟揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)的生成抑制明顯高于龍腦樟和異樟揮發(fā)油,不同化學(xué)型樟揮發(fā)油緩解關(guān)節(jié)炎癥的效果和作用機(jī)制均存在差異。Montero-Villegas等[19]發(fā)現(xiàn)Tagetenone型Lippiaalba揮發(fā)油可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式選擇性地抑制人肝癌細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞增殖,并且降低3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶活性和抑制膽固醇生成。Acimovic等[20]根據(jù)黃花蒿揮發(fā)油組分將其分為4種化學(xué)型：蒿酮+蒿醇型、蒿酮型、樟腦型、非特異性化學(xué)型。以樟腦(44%)、大牛兒烯D(16%)為主的黃花蒿揮發(fā)油對(duì)希拉腸球菌和2種真菌的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用[21]。而以蒿酮(30.7%)、樟腦(15.8%)為主的黃花蒿揮發(fā)油具有良好的抗氧化能力,并對(duì)流感嗜血桿菌、糞鏈球菌、肺炎鏈球菌、克魯斯氏念珠菌有較好的抑制作用[22]。因此,藥用植物通過(guò)化學(xué)型分型并對(duì)其形成機(jī)制研究的深入對(duì)藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要的影響意義。

根據(jù)HS-GC-QQQ-MS/MS分析結(jié)果,來(lái)源于2個(gè)地區(qū)黃花蒿種子在同一環(huán)境下種植生長(zhǎng)可分為2種化學(xué)型,JXAa為蒿酮型,HZAa為樟腦型。在單萜合成路徑中發(fā)現(xiàn)2個(gè)冰片脫氫酶候選基因在樟腦型黃花蒿中顯著高表達(dá),而在蒿酮型黃花蒿中表達(dá)量極低,冰片脫氫酶候選基因的高表達(dá)可能是形成樟腦型黃花蒿的主要原因。蒿酮的生物合成路徑尚未完全解析,目前已知其可能通過(guò)MEP和MVA萜類骨架生成2分子二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP),但并沒(méi)有遵循經(jīng)典的異戊二烯規(guī)則生成單萜前體牻牛兒基焦磷酸,而是生成菊?；沽姿醄23-25],其最后一步蒿醇推測(cè)是通過(guò)ADH2氧化生成蒿酮[26]。本次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)在蒿酮型黃花蒿中高表達(dá)的ADH2候選基因,這可能促進(jìn)蒿酮型黃花蒿中蒿酮的積累。

此外,UFLC-Triple TOF-MS/MS代謝組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)二萜代謝途徑赤霉素合成通路中的化合物與其合成酶基因均在樟腦型黃花蒿中顯著上調(diào)。赤霉素是植物體內(nèi)一類極為重要的激素,影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的生物合成并且受到環(huán)境因子的調(diào)控[27-30]。已有文獻(xiàn)報(bào)道紫外線B照射和植物激素赤霉素協(xié)同促進(jìn)了黃花蒿中青蒿素的積累[31],因此推測(cè)赤霉素對(duì)黃花蒿不同化學(xué)型的形成可能會(huì)有影響。

中國(guó)科學(xué)家屠呦呦從黃花蒿中提取青蒿素,拯救了全球數(shù)百萬(wàn)人的生命,這是中醫(yī)藥獻(xiàn)給世界的一份禮物[32]。然而,黃花蒿還含有豐富的揮發(fā)油,具有良好的抗菌、抗炎、抗病毒作用[9]。熱毒寧注射液在臨床主治由上呼吸道感染(外感風(fēng)熱證)所致的高熱、微惡風(fēng)寒、頭身痛、咳嗽、痰黃等癥[33-34],原料藥中的青蒿藥材來(lái)源于江蘇盱眙青蒿基地,制劑中青蒿藥材的質(zhì)控以蒿酮為主[11]。本研究綜合HS-GC-QQQ-MS/MS、UFLC-Triple TOF-MS/MS和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析了黃花蒿2種化學(xué)型揮發(fā)性成分相關(guān)的萜類代謝物及其相關(guān)基因表達(dá)差異,以及推測(cè)其形成原因,為揭示黃花蒿化學(xué)型形成機(jī)制提供了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),有關(guān)黃花蒿化學(xué)型產(chǎn)生的生物學(xué)機(jī)制有待深入研究。