李冬月 鄭令娜 常盼盼 汪 冰 竺 云 王 萌* 豐偉悅

(1.天津師范大學(xué) 物理與材料科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.中國科學(xué)院高能物理研究所 中科院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100049)

生物體內(nèi)的微量元素雖然含量低，卻參與許多重要的生理過程，還與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。隨著科學(xué)研究的深入，不但需要得到生物樣品中元素總量和元素形態(tài)的信息，還要獲得樣品中元素的空間分布，這為分析化學(xué)提出了新的挑戰(zhàn)。

目前，生物體內(nèi)元素原位成像的分析技術(shù)主要有激光電離質(zhì)譜(Laser Desorption Mass Spectrometry，LDMS)[2]，二次離子質(zhì)譜(Secondary Ion Mass Spectroscopy，SIMS)[3]、激光誘導(dǎo)擊穿光譜(Laser Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS)[4]、X射線熒光光譜(X-ray fluorescence，XRF)[5-6]和激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜(Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，LA-ICP-MS)[7]。其中，LA-ICP-MS具有樣品前處理簡單，分析靈敏度高、線性范圍廣，空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，成為痕量元素原位成像的常用方法[8]。

在LA-ICP-MS進(jìn)行生物元素成像分析時，高能量激光微束轟擊剝蝕池中的生物切片表面，產(chǎn)生的氣溶膠由載氣吹掃進(jìn)入ICP-MS，檢測得到剝蝕區(qū)域的元素信息，再將切片上每個剝蝕微區(qū)的結(jié)果重構(gòu)，得到元素成像圖。由此可見，LA-ICP-MS是一種逐點(diǎn)成像的方法，成像速度主要受到氣溶膠產(chǎn)生和傳輸、質(zhì)譜分析速度等因素的影響。近幾年出現(xiàn)了專用于元素成像的激光剝蝕系統(tǒng)，配有高頻率的激光器(如大于100 Hz)，提高了樣品剝蝕速度[9]。采用低分散(Low Dispersion)快速洗脫剝蝕池，單脈沖激光產(chǎn)生的氣溶膠在剝蝕池中停留時間(即單脈沖響應(yīng)，Single Pulse Response，SPR)縮短至10 ms以下[10]。同時，新一代電感耦合等離子體飛行時間質(zhì)譜(ICP-TOFMS)可以在不到50 μs的時間內(nèi)得到從6Li—238U的全質(zhì)譜圖[11]。上述分析儀器的發(fā)展，極大地提高了LA-ICP-MS成像速度。Vanhaecke組采用低分散激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了每秒250像素的快速元素成像[12]。LA-ICP-MS與免疫技術(shù)結(jié)合后(即成像質(zhì)譜流式技術(shù))能夠以1 μm的分辨率在2 h內(nèi)完成1 mm2大小樣品的元素成像[13]。隨著新一代LA-ICP-MS的發(fā)展，需要發(fā)展與之匹配的成像方法，以實(shí)現(xiàn)快速的生物元素成像。

銀納米顆粒(AgNP)是一種廣譜抗菌、抗病毒和抗炎材料，隨著AgNP在個人護(hù)理產(chǎn)品、保健品以及醫(yī)療用品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，AgNP在生物體內(nèi)代謝和清除受到了廣泛關(guān)注。腎臟是血液過濾和廢物清除的主要器官，在體內(nèi)納米顆粒清除中起著關(guān)鍵作用。本文使用低分散激光剝蝕系統(tǒng)與電感耦合等離子體飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，建立了新的基于點(diǎn)剝蝕的成像模式，實(shí)現(xiàn)了對尾靜脈注射AgNP小鼠腎臟切片的快速元素成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ArF準(zhǔn)分子激光剝蝕系統(tǒng)(Iridia Bio，美國Teledyne公司)，電感耦合等離子體飛行時間質(zhì)譜(icpTOF 2R，瑞士TOFWERK AG公司)，氣溶膠快速進(jìn)樣系統(tǒng)(ARIS，美國Teledyne公司)，冷凍切片機(jī)(LEICA 1900，德國Leica公司)。

高純Ar氣和He氣購自北京普萊克斯公司。銀納米顆粒(AgNP，50 nm，檸檬酸修飾)購自上海滬正納米科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購NIST 612購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。Superfrost防脫玻片購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 動物實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)所用CD1(ICR)小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體重20 g。小鼠尾靜脈注射銀納米顆粒(劑量：6.25 mg/kg，注射體積：200 μL)，24 h后心臟灌流，取腎組織，快速冷凍后用冷凍切片機(jī)制成10 μm厚度的切片，干燥后置于干燥器中備用。

1.3 LA-ICP-TOFMS成像分析

LA與ICP-TOFMS使用ARIS系統(tǒng)連接。激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠由He氣帶出樣品池，進(jìn)入ICP-TOFMS分析。使用NIST 612標(biāo)準(zhǔn)參考物優(yōu)化激光剝蝕系統(tǒng)和ICP-TOFMS的參數(shù)，使115In+的信號最強(qiáng)，同時將氧化物水平(UO+/U+)保持在較低水平。優(yōu)化剝蝕池He氣流速，以獲得最佳的單脈沖響應(yīng)值(SPR)。優(yōu)化激光剝蝕能量密度，達(dá)到樣品最優(yōu)剝蝕效果并減少引入來自基底的干擾。優(yōu)化后的LA-ICP-TOFMS參數(shù)見表1。LA采用點(diǎn)剝蝕模式，激光剝蝕時自動觸發(fā)ICP-TOFMS以標(biāo)準(zhǔn)模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)用HDIP 1.6軟件(美國Teledyne公司)畫出元素成像圖。

表1 LA-ICP-TOFMS儀器參數(shù)Table 1 LA-ICP-TOFMS operating parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 快速成像條件

LA-ICP-MS的元素成像可采用點(diǎn)剝蝕模式或線剝蝕模式(圖1)[14]。點(diǎn)剝蝕模式時，激光束在樣品表面逐點(diǎn)剝蝕采樣，等待剝蝕得到的氣溶膠完全從剝蝕池洗脫后，再進(jìn)行下一點(diǎn)剝蝕。此時，采集的數(shù)據(jù)真實(shí)反映每個采樣點(diǎn)上的元素信息。激光光斑越小，采樣點(diǎn)越多，得到的元素成像圖的分辨率越高。但洗脫時間長的激光剝蝕系統(tǒng)若采用點(diǎn)剝蝕模式會導(dǎo)致成像時間過長。

圖1 兩種剝蝕模式示意圖 A為點(diǎn)剝蝕模式，使用低分散快速剝蝕池；B為線剝蝕模式，使用常規(guī)剝蝕池Figure 1 Schematic diagram of two ablation modes.A：Spot ablation mode using a low dispersion ablation cell；B：Line ablation mode using a standard ablation cell.

線剝蝕模式時，激光束在樣品表面沿直線連續(xù)剝蝕樣品，不同樣品微區(qū)產(chǎn)生的氣溶膠會在剝蝕池內(nèi)發(fā)生一定程度的混合。此時，成像的分辨率取決于光斑尺寸、激光頻率、線掃描速率和剝蝕線間距等條件。線剝蝕模式具有很好的分析靈敏度，但由于不同樣品微區(qū)產(chǎn)生的氣溶膠會混合，造成了成像結(jié)果的失真。文獻(xiàn)中已有的LA-ICP-MS成像分析，受到常規(guī)剝蝕池洗脫時間長(SPR：～1 s)的限制，多數(shù)采用線剝蝕模式以縮短成像時間[15]。

本文使用的低分散快速激光剝蝕系統(tǒng)，配備了快速洗脫剝蝕池和氣溶膠快速引入系統(tǒng)(ARIS)，可以采用點(diǎn)剝蝕模式完成快速成像。優(yōu)化剝蝕池載氣流速，可以得到最佳的SPR。當(dāng)內(nèi)池He流量為0.4 L/min，外池He流量為0.2 L/min時，得到最佳SPR(20 ms±1 ms)，此時可以實(shí)現(xiàn)每秒40像素的成像速度。理論上越小的激光光斑能獲得更高的空間分辨率，但由于成像時間的限制，本文采用20 μm的方形光斑。在點(diǎn)剝蝕模式下，樣品臺移動速度設(shè)為800 μm/s(20 μm×40 Hz)。

LA-ICP-MS成像還要求質(zhì)譜儀具有快速分析瞬時信號的能力，同時能消除譜學(xué)偏離(Spectral Skew)產(chǎn)生的結(jié)果偏差[16]。順序掃描的四級桿ICP-MS在測量時，每個核素測量需要毫秒量級的駐留時間(Dwell Time)和穩(wěn)定時間(Settling Time)[17]，限制了其分析瞬時信號中核素的個數(shù)。與四級桿ICP-MS不同，本文采用的ICP-TOFMS分析速度快，能夠在46 μs得到一張全質(zhì)譜圖(即波形，Waveform)，適合分析瞬時信號。為了獲得更好的信噪比，本文將516張質(zhì)譜圖疊加，這樣每個像素點(diǎn)的采樣時間為23.74 ms，與SPR時間匹配以得到最優(yōu)的成像結(jié)果。此外，在全譜測量時，由于存在高濃度的基體離子，會造成ICP-TOFMS檢測器的飽和。本文使用的ICP-TOFMS采用陷波技術(shù)(Notch Filter)，選擇將質(zhì)荷比為28、32、40、80等四個質(zhì)量數(shù)的基體離子去除，消除了基體離子的影響。

2.2 LA-ICP-TOFMS小鼠腎臟的元素成像

本文使用LA-ICP-MS對暴露AgNP的小鼠腎切片中Ag和其他多種生物微量元素快速成像，采用點(diǎn)剝蝕模式，以20 μm的分辨率分析尺寸為14 mm×7 mm的腎臟切片，分析時間約為2 h。與常規(guī)的LA-ICP-MS系統(tǒng)相比，成像速度提高了約一個數(shù)量級。

圖2 展示了19種元素成像圖，其他元素由于含量低或基體離子干擾，沒有得到清晰的成像結(jié)果。如果采用碰撞池技術(shù)，可以消除多原子離子的干擾[18]，提高52Cr、56Fe、80Se等核素的成像效果。由圖2可見，不同元素在腎切片中具有不同分布模式。P和S等主量元素，在腎臟切片基本呈均勻分布；Na在腎髓質(zhì)中含量較高，這與Na+參與形成腎髓質(zhì)高滲透壓的結(jié)論相一致[19]；Mn與Na的分布相反，在腎髓質(zhì)和腎皮質(zhì)的交界處含量較高，而在腎椎體中含量較低，呈現(xiàn)出中空的圖像；由于腎皮質(zhì)中血流量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于腎髓質(zhì)，因此腎皮質(zhì)的Fe含量(主要來自血細(xì)胞)較高。Ag并不是生命必需元素，在生物體內(nèi)的背景很低，因此圖2中Ag的信號可以認(rèn)為來自于注射的AgNP?？梢钥闯?，AgNP在腎皮質(zhì)及腎皮質(zhì)與腎髓質(zhì)交界區(qū)域含量較高，特別是在腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)交界處的含量高于腎皮質(zhì)區(qū)，而在腎椎體中含量很低。圖3是P、Mn和Ag三種元素合并圖，可以直觀地看出不同元素在腎切片中的不同分布。總之，元素成像可以得到微量元素及金屬納米顆粒在不同微區(qū)的原位分布，為微量元素的微區(qū)代謝、金屬納米材料吸收、分布和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物醫(yī)學(xué)研究提供了直觀可靠的分析手段。

圖2 小鼠腎組織切片元素成像圖Figure 2 Elemental images of a tissue section from a mouse kidney.

生物元素的定量成像需要制備基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。文獻(xiàn)中已有使用定量摻雜金屬的明膠切片作為基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了生物樣品的定量成像的報道[20]。如果將LA-ICP-TOFMS技術(shù)與免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合，使用金屬標(biāo)簽標(biāo)記的抗體，特異性識別組織樣品中待測分子(抗原)，通過測量金屬標(biāo)簽而得到生物切片中多種生物分子的原位分布，進(jìn)一步擴(kuò)展了LA-ICP-TOFMS技術(shù)的應(yīng)用。Giesen等利用上述方法實(shí)現(xiàn)了對腫瘤組織的32 種生物分子的多重成像[21]。

圖3 腎組織切片中P、Mn和Ag疊加元素成像圖Figure 3 The merged image of P Mn and Ag of of a tissue section from a mouse kidney.

3 結(jié)論

本文使用低分散激光剝蝕系統(tǒng)與電感耦合等離子體飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，建立了新的基于點(diǎn)剝蝕的成像模式，實(shí)現(xiàn)了對小鼠腎臟切片的快速、高分辨的多元素成像。LA-ICP-TOFMS成像方法為原位研究生物體內(nèi)元素提供了直觀可靠的手段，有望在生物醫(yī)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用。