劉勃興，趙安奇，張雪佳，王利麗，吳同壘，史秋梅，張志強(qiáng)

（河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066004）

沙門(mén)菌（Salmonella）為一種無(wú)芽孢革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌成員，可感染多種動(dòng)物發(fā)病，也是引起人食物中毒的主要病原之一[1]。沙門(mén)菌可通過(guò)帶菌動(dòng)物、被污染的水和飼料等傳播，威脅多種動(dòng)物和人的公共衛(wèi)生安全。貉感染沙門(mén)菌主要表現(xiàn)為腸炎與敗血癥，臨床癥狀有腹瀉，發(fā)熱，體重減輕，母畜流產(chǎn)等，對(duì)貉的健康養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害[2-3]。研究表明，沙門(mén)菌的致病力是由眾多毒力基因相互作用的結(jié)果，并且相關(guān)基因主要分布于菌毛、毒力島、毒力質(zhì)粒等，對(duì)毒力因子的研究是闡明沙門(mén)菌的致病機(jī)理關(guān)鍵[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外細(xì)菌所致疾病的防治仍以抗生素類(lèi)藥物為主，但近年來(lái)，致病性沙門(mén)菌的耐藥性日益嚴(yán)重，致使許多動(dòng)物疾病無(wú)法有效治療，因此，急需對(duì)致病性沙門(mén)菌的耐藥性和耐藥機(jī)制進(jìn)行調(diào)查研究。

本研究從秦皇島毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)病死貉病料中分離沙門(mén)菌，并對(duì)其致病性和耐藥性進(jìn)行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 本研究從秦皇島毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)收樣107只病死貉，在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)菌采取肝臟、心臟、脾臟等實(shí)質(zhì)器官。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 70只昆明小鼠（體重20±5 g）購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 主要試劑 HE瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購(gòu)自京博奧拓達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物科技股份有限公司；ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；D2000 plus DNA marker購(gòu)自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMaster Mix、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增引物合成和序列測(cè)定服務(wù)均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌的分離純化 采用文獻(xiàn)[6]中的方式，將病料用接種環(huán)接種致HE瓊脂培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h。挑取中心有黑點(diǎn)且顏色呈藍(lán)綠色的菌落接種于LB培養(yǎng)基，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12～18 h。

1.4.2 分離菌的革蘭氏染色 按照革蘭氏染色液說(shuō)明書(shū)對(duì)分離菌染色，用顯微鏡油鏡觀察。

1.4.3 分離菌的生化鑒定 生化鑒定試驗(yàn)按照ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條說(shuō)明書(shū)操作，用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.4.4 分離菌的16S rDNA鑒定 合成16S rDNA通用引物，引物序列為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR完成后將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI的BLAST分區(qū)檢索并比對(duì)分析。

1.5 分離菌的致病性試驗(yàn) 參照參考文獻(xiàn)[6]的方法，以小鼠為動(dòng)物模型致病性試驗(yàn)。將純化后的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，離心棄上清液，用無(wú)菌的PBS緩沖液重懸并調(diào)整菌液濃度為1×107CFU/mL。每株沙門(mén)菌為一個(gè)感染組，每組5只小鼠，腹腔注射0.1 mL調(diào)整濃度后菌液。設(shè)置對(duì)照組1組，5只小鼠，每只小鼠分別注射0.1 mL無(wú)菌PBS。觀察各組小鼠狀態(tài)，記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，剖檢死亡小鼠，分離實(shí)質(zhì)器官細(xì)菌并鑒定。

1.6 分離菌的毒力基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[7-8]合成沙門(mén)菌的毒力基因引物（表1）。以提取的分離菌的DNA作為模板進(jìn)行PCR，檢測(cè)分離菌的毒力基因攜帶情況。

表1 沙門(mén)菌毒力基因引物序列Table 1 Primer sequence of Salmonella virulence gene

1.7 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 采取KB紙片法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)分離菌對(duì)15種獸醫(yī)臨床常用藥的敏感性，試驗(yàn)操作以及判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)的抗生素分別為：β-內(nèi)酰胺類(lèi)（氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林），氨基糖苷類(lèi)（阿米卡星、新霉素、卡那霉素），四環(huán)素類(lèi)（多西環(huán)素、土霉素），氟喹諾酮類(lèi)（環(huán)丙沙星、恩諾沙星），氯霉素類(lèi)（氟苯尼考），大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（替米考星），磺胺類(lèi)（磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復(fù)方新諾明）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 將107份病料接種于HE瓊脂培養(yǎng)基，共分離到13株細(xì)菌。革蘭氏染色結(jié)果顯示，13株分離菌為革蘭氏陰性小桿菌。細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果經(jīng)ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)判定，13株分離菌為沙門(mén)菌，符合率為99.7%～99.9%，符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中沙門(mén)菌的生化特性。16S rDNA鑒定結(jié)果顯示，13株菌與NCBI中報(bào)道的沙門(mén)菌屬參考菌株同源性最高，同源率為99%～100%。

2.2 分離菌的致病性試驗(yàn) 感染小鼠后，對(duì)各組小鼠持續(xù)觀察2周。感染組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、紊亂，精神狀態(tài)萎靡。各感染組小鼠死亡情況見(jiàn)表2，剖檢死亡小鼠，小鼠肝臟、肺臟等器官有明顯出血點(diǎn)、淤血，脾臟腫大，腹腔出血，有積液。對(duì)照組小鼠無(wú)死亡，狀態(tài)良好，無(wú)病征。分離感染組死亡小鼠肝臟、肺臟、脾臟等器官細(xì)菌，經(jīng)鑒定為沙門(mén)菌，生化鑒定等鑒定結(jié)果與感染菌株特征相近。

2.3 分離菌的毒力基因檢測(cè) 毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，13株沙門(mén)菌分別檢出3～7個(gè)毒力基因，具體見(jiàn)表2。19種毒力基因中，未檢出fimA、sseC、sseL、inaV基因，其余15種毒力基因均有檢出，各基因檢出率見(jiàn)圖1。spv R基因檢出率最高，為69.23%（9/19）。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Colony morphology and Gram staining results of isolated bacteria

表2 13株分離菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果與小鼠死亡情況Table 2 Virulence gene test results of 13 isolates and death in mice

圖2 13株分離菌各毒力基因檢出率Fig.2 Detection rate of virulence genes of 13 isolates

2.4 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 13株沙門(mén)菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示（表3和圖3），13株沙門(mén)菌分別對(duì)5～14種抗生素耐藥，對(duì)土霉素、替米考星、磺胺二甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明耐藥率高達(dá)100%（13/13），對(duì)阿米卡星敏感率最高，為53.85%（7/13）。

圖3 13株分離菌的耐藥情況Fig.3 Drug resistance of 13 isolates

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模和密度日益增加，相關(guān)疾病的報(bào)道也逐漸增加，其中，細(xì)菌病占據(jù)較大比重[9]。在國(guó)內(nèi)，在河北省樂(lè)亭縣、山東省、黑龍江省鐵力市等均報(bào)道沙門(mén)菌感染貉發(fā)病死亡的病例[3,10-11]。在本研究中，從秦皇島市的107份貉病料中分離出13株沙門(mén)菌，分離率為12.15%，并通過(guò)小鼠致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離菌株均具有一定的毒力，說(shuō)明沙門(mén)菌是致貉發(fā)病死亡的重要病原。

毒力因子在沙門(mén)菌感染發(fā)病過(guò)程中有重要的作用，因此，本研究用PCR方法檢測(cè)13株沙門(mén)菌的毒力島、毒力質(zhì)粒、菌毛等共計(jì)19種毒力基因的攜帶情況。結(jié)果顯示，spv相關(guān)基因（spvR、spvA、spvB、spvC、spvD）檢出率較高。spv是沙門(mén)菌毒力質(zhì)粒（Salmonellaplasmid virulence,spv），大小為50～90 kb，有6個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）組成，包括正性調(diào)控基因spvR，spvA、spvB、spvC、spvD4個(gè)效應(yīng)基因和orfE基因[12]。spv基因與沙門(mén)菌的粘附、定殖和血清抗性等毒力表型有關(guān)，是沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞生存的必需基因[13]。本研究中，秦皇島地區(qū)貉源沙門(mén)菌spv基因檢出率較高，表明在該地區(qū)spv基因在分子水平上較為流行，值得進(jìn)一步探討研究spv與貉源沙門(mén)菌致病性之間的關(guān)系。

沙門(mén)菌存在多種耐藥機(jī)制，如靶位基因突變，酶解作用，藥物外排，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子介導(dǎo)的耐藥等，并且可通過(guò)多種方式從環(huán)境中獲得耐藥性[14]。沙門(mén)菌復(fù)雜的耐藥性產(chǎn)生機(jī)制以及抗生素類(lèi)藥物的濫用等原因?qū)е律抽T(mén)菌耐藥情況日益嚴(yán)重[15]。本研究中，13株沙門(mén)菌分別對(duì)5～14種抗生素耐藥，其中10株對(duì)10種及以上抗生素耐藥，對(duì)土霉素、替米考星、磺胺二甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明耐藥率高達(dá)100%，耐藥情況較為嚴(yán)重。孫娜等[16]分離的狐源沙門(mén)菌對(duì)頭孢類(lèi)藥物、左氧氟沙星和多粘菌素較敏感，對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物、四環(huán)素、氨芐西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素全部表現(xiàn)為耐藥。王海龍等[17]分離的水貂源沙門(mén)菌對(duì)環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、頭孢曲松鈉高敏，對(duì)丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素低敏。多組數(shù)據(jù)顯示，毛皮動(dòng)物沙門(mén)菌的耐藥性普遍存在，耐藥情況較為嚴(yán)重，并且不同來(lái)源的沙門(mén)菌耐藥情況不同，因此，在臨床治療過(guò)程中應(yīng)注意合理應(yīng)抗生素，并應(yīng)根據(jù)致病菌株對(duì)抗生素的敏感情況篩選出最適藥物進(jìn)行治療。

本研究從秦皇島地區(qū)病死貉分離出13株沙門(mén)菌，分離到的菌株對(duì)小鼠具有不同程度的致病性，且分離spv毒力基因檢出率較高，通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離菌株具有嚴(yán)重的耐藥性。本研究為秦皇島地區(qū)由沙門(mén)菌感染所致貉相關(guān)疾病的研究提供參考。