陳書秀 孫娟 李霞 趙楠 史良 李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東煙臺 264003)

籠目海帶(Saccharinasculpera)又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，隸屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，其營養(yǎng)豐富，是海帶中的優(yōu)勢品種。該藻體內(nèi)含有優(yōu)質(zhì)巖藻聚糖硫酸酯、褐藻膠等各種活性成分，其酶解產(chǎn)物或水提物又含有各種次級代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性風味物質(zhì)[1]。根據(jù)這些活性成分，可以研發(fā)各類保健類食品、醫(yī)藥產(chǎn)品等[2-3]。因此，籠目海帶的市場需求日益增大。近年來，有關(guān)籠目海帶的報道主要針對其黏性多糖的性質(zhì)、褐藻膠的提取方法以及多糖的生物活性的研究等方面[4-12]，對于籠目海帶養(yǎng)殖育苗方面的研究較少[13-14]。利用配子體進行育苗是推進籠目海帶大規(guī)模育苗及海上養(yǎng)殖的新技術(shù)工藝，其中配子體的快速同步促熟是該工藝的關(guān)鍵技術(shù)。陳書秀等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，籠目海帶配子體發(fā)育的最適溫度為8～12 ℃，在光照強度20 μmol·m-2s-1下，20L(光照)∶4D(黑暗)的光照周期對配子體發(fā)育最有利。

除了溫度、光照、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子以外，鹽度也對海藻生長、發(fā)育及繁殖起著重要作用。當海藻處于鹽分逆境時，海藻的生長受阻，其光合生理作用也會受到影響。如在低鹽度條件下，壇紫菜(Porphyrahaitanensis)和裂片石莼(Ulvafasciata)的有效光化學速率和光合放氧速率均受到顯著影響[15-16]。劉萌萌等[17]研究表明，鹽度達到15后穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)生長停滯，藻體逐漸死亡。宋新丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫逆境會顯著影響羊棲菜(Sargassumfusiforme)幼體的光合放氧能力。另外，鹽度對海藻的游孢子附著或配子體萌發(fā)等有顯著影響，萱藻(Scytosiphonlomentaria)孢子附著的最適鹽度為30，鹽度過低(≤24)或過高(≥40)都會造成孢子死亡[19]?？资?UlvapertusaKjellm)在鹽度20和25的條件下最有利于其體細胞轉(zhuǎn)化成繁殖細胞，而在鹽度5的條件下體細胞僅有少數(shù)繼續(xù)發(fā)育[20]。

本研究以籠目海帶雌、雄配子體為試驗材料，通過顯微觀察配子體的生長發(fā)育狀態(tài)，計算配子體發(fā)育率等，探究不同鹽度對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響，旨在探索有利于籠目海帶配子體發(fā)育的最適鹽度條件，為籠目海帶配子體規(guī)?；瘮U增培養(yǎng)及育苗提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)條件

試驗用海帶配子體為籠目海帶。取適量的雌、雄配子體分別用孔徑50 μm(300目)篩絹過濾，獲得2～5個細胞的細胞段懸濁液。然后按照雌、雄質(zhì)量比2∶1混合均勻，取10 mL懸濁液加入直徑12 cm的培養(yǎng)皿中，在不同的溫度下進行培養(yǎng)，光周期為10L∶14D，光照強度為20 μmol·m-2s-1。在不同鹽度的海水中添加NaNO3、KH2PO4、檸檬酸鐵作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中總有效氮為10 mg/L，有效磷為1 mg/L，有效鐵為0.05 mg/L。采用海水素配制鹽度分別為15、20、25、30、35、40、45的海水，每個處理組設3個重復，每3 d鏡檢觀察并更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)周期為30 d。

1.2 配子體生長、發(fā)育指標的測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發(fā)育狀態(tài)，每3 d拍照1次，試驗周期為30 d。

配子體發(fā)育率的計算：每個培養(yǎng)皿隨機觀察10個100×視野，分別統(tǒng)計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數(shù)，發(fā)育率(%)=100×(卵囊形成數(shù)+排卵數(shù)+孢子體數(shù))/總細胞數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對發(fā)育率數(shù)據(jù)進行單因子方差分析和多重比較分析，設P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用EXCEL軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽度對籠目海帶配子體細胞形態(tài)的影響

當鹽度為45時，籠目海帶配子體克隆系僅進行營養(yǎng)生長而不進行發(fā)育，整個試驗觀察期內(nèi)均無卵囊形成，其外觀形態(tài)變化見圖1-a～c。在鹽度20～35的條件下，15 d后，約有3%的雌配子體發(fā)育為成熟的卵囊(見圖1-d)；15～28 d，大部分配子體萌發(fā)成為成熟卵囊、排卵并形成幼苗(見圖1-e～f)。

a.打碎后的雌配子體；b.雌配子體營養(yǎng)生長初期；c.雌配子體營養(yǎng)生長后期；d.雌配子體卵囊形成；e.雌配子體排卵；f.幼孢子早期形態(tài)。圖1 籠目海帶雌配子體生長發(fā)育過程

第28天時，不同鹽度下籠目海帶配子體生長發(fā)育狀態(tài)見圖2。當鹽度為45時，隨著培養(yǎng)時間的延長，籠目海帶配子體細胞段分支顏色加深，細胞質(zhì)分布均勻，細胞段數(shù)目增多，配子體的細胞數(shù)量顯著高于其他各組(見圖2-g)；鹽度40處理組與鹽度45處理組沒有顯著差異，僅在第28天時觀察發(fā)現(xiàn)有極少量的孢子體(見圖2-f)；在鹽度為20、25和30的條件下，配子體發(fā)育率在60%～80%，其中50%左右為多細胞孢子體(見圖2-b～d)；鹽度35處理組最終的卵囊形成率、排卵率及小苗率顯著低于鹽度20～30處理組(見圖2-e)；而鹽度15處理組的配子體細胞膨大呈球形，后期大量死亡，極少數(shù)的存活細胞生長極度緩慢且不進行發(fā)育(見圖2-a)。

a.鹽度15；b.鹽度20；c.鹽度25；d.鹽度30；e.鹽度35；f.鹽度40；g.鹽度45。圖2 不同鹽度下籠目海帶配子體生長發(fā)育狀態(tài)(第28天)

2.2 不同鹽度對籠目海帶配子體由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向發(fā)育生殖的影響

在海帶配子體發(fā)育成幼苗的過程中，雌配子體卵囊形成、排卵和幼苗出現(xiàn)時的形態(tài)變化明顯，易于觀察和統(tǒng)計，因此選擇發(fā)育率，即卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和幼孢子體數(shù)之和占總細胞數(shù)的百分比作為衡量海帶配子體發(fā)育的指標[21]。

不同鹽度、培養(yǎng)天數(shù)對籠目海帶配子體發(fā)育的方差分析結(jié)果見表1。由表1可以看出，鹽度(P<0.001)、培養(yǎng)天數(shù)(P<0.001)及二者交互作用(P<0.001)對籠目海帶配子體的發(fā)育均有極顯著的影響。第1行校正模型中的F=88.479，P<0.001，表明所用模型有統(tǒng)計學意義。鹽度的偏Eta2(0.952)>(培養(yǎng)天數(shù)×鹽度)的偏Eta2(0.933)>培養(yǎng)天數(shù)的偏Eta2(0.906)，表明這3個因素對籠目海帶發(fā)育的影響效應為：鹽度>培養(yǎng)天數(shù)×鹽度>培養(yǎng)天數(shù)。

表1 不同鹽度、培養(yǎng)天數(shù)對籠目海帶配子體發(fā)育的方差分析結(jié)果

不同鹽度條件下籠目海帶的發(fā)育情況見表2。配子體發(fā)育培養(yǎng)第15天，在鹽度20～35處理組發(fā)現(xiàn)有卵囊形成并排卵，其他鹽度處理組的配子體均處于營養(yǎng)生長。鹽度15、45處理組在整個培養(yǎng)周期中均未見配子體發(fā)育，鹽度40處理組僅在第28天觀察到少量的孢子體。多重比較結(jié)果表明，在整個培養(yǎng)周期中，鹽度對籠目海帶配子體發(fā)育率有顯著的影響(P<0.05)(見表3)。從第19天開始，鹽度20～30處理組的發(fā)育率顯著高于其他各組(P<0.05)。第28天，鹽度25、30處理組的最終發(fā)育率為79.26%、71.36%，鹽度20處理組的最終發(fā)育率為58.87%(見表3)。

表2 不同鹽度條件下籠目海帶的發(fā)育情況 單位：%

表3 鹽度對籠目海帶配子體發(fā)育率的影響 單位：%

綜上所述，在鹽度20～35條件下，籠目海帶配子體均可正常發(fā)育。從最終發(fā)育率及幼孢子體存活率情況可見，最適于籠目海帶配子體發(fā)育的鹽度為25～30，適當降低海水鹽度有利于促進配子體由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向發(fā)育生殖。高鹽度(35～45)更有利于配子體的營養(yǎng)生長，但對籠目海帶配子體的發(fā)育會產(chǎn)生抑制作用。

3 討論

鹽度作為海水介質(zhì)的重要參數(shù)，對海藻生長、發(fā)育及繁殖起到重要作用。近幾年，有關(guān)鹽度變化對大型海藻生長影響的研究主要集中在成熟藻體，在海藻早期發(fā)育階段如游孢子或配子萌發(fā)等的研究較少。本試驗以籠目海帶配子體為材料，研究了不同鹽度對其配子體發(fā)育的影響，結(jié)果表明，在鹽度20～30條件下，籠目海帶配子體大部分(60%～80%)進入了生殖生長狀態(tài)，且其中50%以上為多細胞孢子體。在鹽度35的條件下，大部分籠目海帶配子體(80%～90%)維持在營養(yǎng)生長狀態(tài)，雖然小部分配子體(7.30%)進入了生殖生長狀態(tài)，但生殖生長明顯滯后于鹽度20～30處理組。在鹽度40和45條件下，所有海帶配子體維持在營養(yǎng)生長狀態(tài)。此結(jié)果與孔石莼[20]、寬礁膜[22]等海藻的早期發(fā)育條件相似。王帥[20]研究表明，孔石莼在低鹽度(鹽度5)條件下，其體細胞僅有少數(shù)繼續(xù)發(fā)育成繁殖細胞；鹽度在10～25的條件下對孔石莼體細胞成熟有一定的促進作用，其中鹽度為20和25時最有利于孔石莼體細胞轉(zhuǎn)化成繁殖細胞。王惠[22]研究表明，在低鹽度(鹽度10)條件下，寬礁膜游孢子不能正常萌發(fā)，在高鹽度(鹽度40)條件下，游孢子大部分處于休眠狀態(tài)，只完成細胞增大，不分裂。

本研究中，不同鹽度下籠目海帶最終發(fā)育率及幼孢子體存活率的結(jié)果表明，最適合于籠目海帶配子體發(fā)育的鹽度為25～30，適當降低鹽度有利于促進配子體由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向發(fā)育生殖。高鹽度(35～45)更有利于配子體的營養(yǎng)生長，但會對籠目海帶配子體發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。因此，在籠目海帶配子體培養(yǎng)過程中，可以通過鹽度的變化來調(diào)控配子體的生長發(fā)育。