陳健勇，許俏苑

（廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095）

上呼吸道感染為常見多發(fā)病癥，寒熱交替、環(huán)境潮濕和人群密集時(shí)猶易爆發(fā)[1]。除注意時(shí)常清洗手、口、鼻，加強(qiáng)鍛煉，注意環(huán)境通風(fēng)等良好衛(wèi)生、生活習(xí)慣養(yǎng)成外，西醫(yī)多根據(jù)病癥及相關(guān)生化指標(biāo)使用非甾體抗炎藥、抗生素或抗病毒藥進(jìn)行治療[2-3]。中醫(yī)則將該病癥歸為濕氣、寒邪入侵[4]，治療也以行氣解表，清熱解毒等為主[5]。銀翹清咽顆粒由我院臨床驗(yàn)方改進(jìn)、優(yōu)化所得，主要藥味為金銀花、連翹、板藍(lán)根、大青葉、升麻等，具有清熱解毒、利咽消腫、行氣解表的功效，常用于外感風(fēng)寒所致的流涕、咳嗽[6-8]。研究表明，中藥治療上呼吸道感染的機(jī)制，可能與其調(diào)控機(jī)體白介素-6（ⅠL-6）水平密切相關(guān)[9-11]。ⅠL-6是機(jī)體內(nèi)調(diào)控多種免疫反應(yīng)的重要遞質(zhì)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或出現(xiàn)細(xì)菌、病毒感染等異常狀況時(shí)，ⅠL-6水平出現(xiàn)不同程度的升高并向病變部位聚集[12-13]。因此，找到并評(píng)價(jià)銀翹清咽顆粒中ⅠL-6調(diào)控活性成分，并建立同時(shí)、準(zhǔn)確測(cè)定這些成分含量的方法，是研究該制劑功效機(jī)理和物質(zhì)基礎(chǔ)的重要途徑。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器Ⅴarioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配備PDA檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；Mettler-Toledo精密分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥、材料和試劑 綠原酸（批號(hào)110753-201817，純度96.1%）、連翹苷（批號(hào)：110821-201816，純 度94.9%）、腺苷（批號(hào)：110879-201703，純度99.7%）、靛玉紅（批號(hào)：110717-201805，純度99.1%）、升麻素苷（批號(hào)：111522-201913，純度94.6%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201818，純度95.3%）、柚皮苷（批號(hào)：110722-201815，純度93.5%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（中國(guó)）；表告依春（批號(hào)：B-014，純度98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司（中國(guó)），直鐵線蓮寧B為實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)UⅤ測(cè)定純度98%以上。THP-1細(xì)胞液購(gòu)自ATCC公司（美國(guó)），分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和HPLC分析用DMSO、乙腈、磷酸均為色譜純，購(gòu)自Merck（德國(guó)），供試品制備用甲醇為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠（中國(guó)）；ELⅠSA試劑盒購(gòu)自Abcam公司；銀翹清咽顆粒（批號(hào)：J1808002-1～3、J1902001-1～4、J1907005-1～3）系廣東省第二中醫(yī)院制劑室制備。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 ⅠL-6調(diào)控活性成分篩選 精密吸取THP-1細(xì)胞液100μL，依次加入培養(yǎng)基、各組分對(duì)照品單體溶液（DMSO溶液，25mmol），一 抗（ⅠL-6抗 體，批號(hào)：ab234570）、二抗（鼠-ⅠgG，批號(hào)：ab189578），按試劑盒說(shuō)明書和文獻(xiàn)報(bào)道方法處理[12]，酶標(biāo)儀測(cè)定各組熒光量，將結(jié)果與對(duì)照組（僅加入DMSO）進(jìn)行比較。所得測(cè)定值結(jié)果（相對(duì)表達(dá)值）代入SPSS軟件中，使用one way-ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)比各給藥組與對(duì)照組的差異。結(jié)果表明，綠原酸、連翹苷、腺苷、靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷等成分具有較為明顯的調(diào)控活性（P＜0.01），橙皮苷、柚皮苷與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見圖1。

圖1 各成分ⅠL-6調(diào)控活性

2.2 含量測(cè)定樣品制備方法

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備方法 取綠原酸、連翹苷、腺苷、靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷對(duì)照品，分別精密稱定約1mg，置于同一10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得上述各化合物含量均為100μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備方法 取銀翹清咽顆粒，精密稱取約5g，置于25mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，精密稱重，超聲處理30min，取出，冷卻后精密稱重，加50%甲醇補(bǔ)足減失重量，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 HPLC同時(shí)測(cè)定方法 取對(duì)照品和供試品溶液，使用Agilent EC C18色譜柱（柱長(zhǎng)250mm，直徑4.6mm，粒徑5μm），0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，程序：0～15min，90%-75%A；15～25min，75%-50%A；25～40min，50%-10%A；40～55min，10%-10%A；55～60min，10%-90%A。流 速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。記錄對(duì)照品和供試品色譜圖，并進(jìn)行峰指認(rèn)，將供試品中峰面積≥對(duì)照品中峰面積10%的成分列為含量測(cè)定指標(biāo)，所得色譜圖見圖2。

圖2 銀翹清咽顆粒含量測(cè)定供試品（A）和混合對(duì)照品（B，各成分濃度均為100μg/mL）色譜圖

2.4 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取綠原酸、連翹苷、腺苷對(duì)照品，精密稱取約2mg，置于同一5mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，即得三種化合物濃度均為400μg/mL的溶液；精密吸取上述溶液適量，置于多個(gè)5mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度，即得上述各成分濃度均為5、10、20、50、100、200μg/mL的溶液。吸取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，記錄各成分峰面積，通過(guò)線性回歸計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。得腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=31027x+24791（r2=0.9996），連翹苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3690.3x-1767.9（r2=0.9997），綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6705.4x-358.69（r2=0.9997）。結(jié)果表明，本方法所測(cè)定結(jié)果在5～200μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.83%、1.06%和1.22%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批銀翹清咽顆粒（批號(hào)：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，共平行制備6份，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，記錄各成分峰面積，計(jì)算上述成分的含量和含量的RSD。結(jié)果顯示，腺苷、綠原酸、連翹苷含量的RSD分別為0.87%、1.31%和1.40%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取銀翹清咽顆粒，精密稱取約2.5g，置于25mL錐形瓶中，精密加入綠原酸、連翹苷、腺苷混合對(duì)照品溶液適量（供試品中濃度見表1、表2、表3），分別記為低、中、高三個(gè)濃度，按“2.2.2”所述方法，自“精密加入50%甲醇25mL”起制備供試品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份。取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，記錄各成分峰面積，計(jì)算上述成分的含量、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示，腺苷的平均回收率為98.61%、RSD為2.24%；綠原酸的平均回收率為100.70%、RSD為2.72%；連翹苷的平均回收率為100.24%、RSD為2.81%。上述結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 連翹苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，放置在自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于放置后0、2、4、6、8、12h按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，記錄各成分峰面積，計(jì)算上述成分的含量和含量的RSD。結(jié)果得腺苷、連翹苷、綠原酸含量的RSD分別為1.47%、1.05%和0.93%，表明方法所制備樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 IL-6調(diào)控活性成分同時(shí)測(cè)定 取各批次銀翹清咽顆粒，按“2.2.2”所述方法制備供試品溶液，按“2.3”所述HPLC方法測(cè)定，記錄各成分峰面積，計(jì)算上述成分的含量。結(jié)果得腺苷、連翹苷、綠原酸的 含 量 分 別 為0.1622～0.2157mg/g、0.5602～0.6904mg/g、0.4033～0.5091mg/g，見表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生發(fā)熱、感冒、損傷等炎癥反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)的ⅠL類成分合成量顯著增加，且向病變部位聚集，加劇炎癥反應(yīng)癥狀，升高機(jī)體產(chǎn)熱、體溫，增加能量和相關(guān)物質(zhì)代謝，使相關(guān)病癥加重，因此ⅠL可以作為評(píng)價(jià)病程和藥物療效的重要指標(biāo)。ⅠL-6調(diào)控活性篩選結(jié)果可知，橙皮苷、柚皮苷并無(wú)明顯的ⅠL-6調(diào)控活性，這可能與上述成分主要活性為抗氧化、清除自由基有關(guān)，因此并無(wú)與炎癥反應(yīng)和ⅠL-6代謝通路相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合并起調(diào)控作用的能力。雖然上述成分對(duì)銀翹清咽顆粒的治療功效可能有一定貢獻(xiàn)，但由于本研究主要聚焦于ⅠL-6調(diào)控活性成分，且橙皮苷、柚皮苷藥理活性研究已有較多報(bào)道[14]，故本文暫不涉及。

由于銀翹清咽顆粒為多藥味復(fù)方中藥制劑，且ⅠL-6調(diào)控活性研究結(jié)果顯示方中主要活性成分化學(xué)性質(zhì)差異較大，因此各目標(biāo)成分的洗脫時(shí)間差異較為明顯，為這些同時(shí)測(cè)定和基線分離提供了一定的便利性[15]。但與此同時(shí)，藥材提取、藥物制劑工藝、供試品制備方法和分離檢測(cè)用固定相、流動(dòng)相等相比傳統(tǒng)的測(cè)定一類同系物的含量測(cè)定研究，對(duì)各組分色譜行為、峰型、信號(hào)強(qiáng)度影響也更為顯著。為建立多指標(biāo)活性成分同時(shí)測(cè)定方法，本實(shí)驗(yàn)在色譜條件摸索過(guò)程中，主要考慮增加信號(hào)強(qiáng)度最低成分（在本實(shí)驗(yàn)中為連翹苷）的響應(yīng)值，對(duì)其他成分的信號(hào)強(qiáng)度有一定犧牲，但并未影響目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確測(cè)定，故采用。

由圖2可知，靛玉紅、表告依春、直鐵線蓮寧B、升麻素苷等成分的對(duì)照品溶液雖能正常出峰[16]，但在供試品中未檢出或含量不符合要求（低于對(duì)照品的10%，即在銀翹清咽顆粒中含量低于1/10000），因此并未被列入含量測(cè)定指標(biāo)成分中。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因，可能是制備顆粒用浸膏的過(guò)程中，為保持制劑與原中藥湯劑的一致性而采用水提，因此出現(xiàn)部分成分含量較低或未檢出。在今后的研究中，可考慮使用乙醇提取或高速逆流色譜法、超臨界萃取法等手段，增加有效成分的種類和含量。

總而言之，本研究對(duì)銀翹清咽顆粒中多種成分進(jìn)行了ⅠL-6調(diào)控活性評(píng)價(jià)和含量測(cè)定研究，建立了基于功效主治的多指標(biāo)含量測(cè)定方法，最終確定綠原酸、連翹苷、腺苷等三個(gè)成分同時(shí)具有明顯的ⅠL-6調(diào)控活性和適宜的含量，可作為評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分。