陳鵬云 趙永拓 高 軍

（鲅魚圈海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧營(yíng)口 115000）

金黃色葡萄球菌是引發(fā)食源性中毒的一種重要病原體，而牛奶和乳制品是金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的良好基質(zhì)[1～2]。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)金黃色葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)達(dá)到大約106CFU/g時(shí)會(huì)產(chǎn)生腸毒素[3]。金黃色葡萄球菌腸毒素（SEs）根據(jù)其抗原特性分為5種 經(jīng)典的血清型，分別為SEA、SEB、SEC、SED和SEE[4]；除此之外，近幾年有越來越多的新型腸毒素被報(bào)道，如SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，SEs對(duì)胃腸蛋白酶（如胃蛋白酶）和高溫滅活具有抗性[6]。在食品安全方面，熱穩(wěn)定性是SEs最重要的特性之一。盡管巴氏殺菌會(huì)殺死金黃色葡萄球菌，但具有耐熱性的SEs通常會(huì)保持其生物活性[7]。金黃色葡萄球菌食物中毒是攝入含有0.02～1 μg SEs的食物后發(fā)生的一種輕度中毒，非常低劑量的SEs就會(huì)導(dǎo)致人們出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹部絞痛、腹瀉等中毒癥狀[8]。然而，更為嚴(yán)重的是，隨著抗菌藥物的大規(guī)模使用，很多菌株已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性。因此，對(duì)生乳及乳制品中產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株及其耐藥性進(jìn)行鑒定和檢測(cè)顯得尤為重要[9]。本研究在從生乳和乳制品樣品中分離得到凝固酶陽性葡萄球菌（CPS）的基礎(chǔ)上，使用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法識(shí)別出產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株，并對(duì)金黃色葡萄球菌菌株的耐藥性進(jìn)行試驗(yàn)。

一、材料與方法

（一）生牛乳和乳制品樣品從各零售店收集244個(gè)生牛奶和乳制品樣品，其中包括生牛奶樣品120個(gè)、白奶酪樣品64個(gè)、馬蘇里拉奶酪樣品20個(gè)、黃油樣品20個(gè)和冰淇淋樣品20個(gè)。所有樣品收集后，立即用冷藏箱（4～8℃）運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，送到實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行分析（分析之前保持在4℃溫度下儲(chǔ)存）。

（二）主要試劑及培養(yǎng)基蛋白胨（北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司）；Baird-Parker瓊脂（上海博湖生物科技有限公司）；兔血漿（上海源葉生物科技有限公司）；EDTA（濰坊濱海石油化工有限公司）；溶菌酶（山東淄博山川藥業(yè)有限公司）；蛋白酶K（武漢華玖醫(yī)藥科技有限公司）；dNTP（北京百奧萊博科技有限公司）；Taq DNA聚合酶（上海博耀生物科技有限公司）；抗菌藥物青霉素G、頭孢西丁、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、四環(huán)素、紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、克林霉素、氯霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、磷霉素、夫西地酸、新生霉素和桿菌肽均購自湖北九洲康達(dá)生物科技有限公司。

（三）主要儀器MJP－150細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海培因有限公司）；TG18W低溫高速離心機(jī)（濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司）；HH－ZK4電熱恒溫水浴鍋（鄭州卓成儀器科技有限公司）；TCT6－I/II PCR擴(kuò)增儀（上海江萊生物科技有限公司）。

（四）試驗(yàn)方法

1.凝固酶陽性葡萄球菌的分離。從每個(gè)樣品中取出10 g，放入裝有90 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的無菌蛋白胨水的無菌塑料袋中。每個(gè)樣品均質(zhì)2 min后，將勻漿物涂到Baird-Parker瓊脂平板上，并在有氧條件下，37℃持續(xù)培養(yǎng)24～48 h。選擇5個(gè)典型或非典型菌落，并使用兔血漿和EDTA生產(chǎn)凝固酶。

2.DNA提取。將樣品重懸浮于50 μL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶菌酶溶液中，37℃下孵育10 min。加入100 μg/mL蛋白酶K溶液50 μL和0.1 mol/L Tris－HCl緩沖液（pH 7.5）150 μL，37℃下再培養(yǎng)10 min。接著沸水浴5 min，以12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，此即為用于后續(xù)PCR反應(yīng)的DNA模板。

3.多重PCR條件。PCR反應(yīng)體系：體積為50 μL，含 有0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2、20 μmol/L上下游引物、10 mmol/L Tris－HCl（pH 8.3）、1.5 U Taq DNA聚合酶、50 mmol/L KCl、5 μL 10×反應(yīng)緩沖液、2 μL模板DNA和無菌水。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃下預(yù)變性5 min；94℃變 性2 min，55℃退 火2 min，72℃延 伸1 min，循環(huán)35次；72℃終延伸7 min。取20 μL多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加4 μL染料，加載到2.0%瓊脂糖凝膠電泳上，在90 V電壓下進(jìn)行1.5 h電泳后，于紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

4.16S rRNA、nuc和SEs編碼基因的測(cè)定。通過多重PCR對(duì)204株凝固酶陽性葡萄球菌進(jìn)行了16S rRNA、nuc、SEs編碼基因測(cè)定，具體引物見表1。

表1 引物序列

5.金黃色葡萄球菌分離株耐藥性試驗(yàn)。采用盤擴(kuò)散法檢查金黃色葡萄球菌分離株在MuellerHinton瓊脂平板上的耐藥性，使用的抗菌藥物包括青霉素G（10 IU）、頭孢西?。?0 μg）、慶大霉素（10 μg）、阿米卡星（30 μg）、卡那霉素（30 μg）、妥布霉素（10 μg）、新霉素（30 μg）、四環(huán)素（30 μg）、紅霉素（15 μg）、螺旋霉素（100 μg）、林可霉素（15 μg）、氧氟沙星（15 μg）、諾氟沙星 （15 μg）、克林霉素（2 μg）、氯霉素（30 μg）、甲氧芐啶（1.25 μg）、磺胺甲惡唑（23.75 μg）、磷霉素（50 μg）、夫西地酸（10 μg）、新生霉素（30 μg）和桿菌肽（10 IU）。金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽性對(duì)照菌株。

二、結(jié)果與分析

（一）凝固酶陽性葡萄球菌在生乳和乳制品樣品中的分布情況本研究中，在128個(gè)凝固酶陽性葡萄球菌陽性樣品中檢測(cè)到204株凝固酶陽性葡萄球菌，涉及生牛奶 （90/120，75.0%）、白奶酪（24/64，37.5%）、馬蘇里拉奶酪（6/20，30.0%）、黃油（6/20，30.0%）和冰淇淋（2/20，10.0%）樣品（見表2）。

表2 CPS在生乳和乳制品樣品中的分布情況

（二）SEs編碼基因檢測(cè)情況多重PCR檢測(cè)SEs編碼基因結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，生牛奶樣品中有14株分離株（14/102，13.7%）檢出SEs編碼基因，其中10株（10/14，71.4%）檢出sea基因，2株（2/14，14.3%）檢出seb基因，2株（2/14，14.3%）檢出sea+seb基因；白奶酪樣品中有8株分離株（8/42，19.0%）檢出SEs編碼基因，其中各有2株（2/8，25.0%）檢出sea、sec、sed和sea+sed基因；馬蘇里拉奶酪樣品中有4株分離株（4/8，50.0%）檢出SEs編碼基因，其中2株（2/4，50.0%）檢出sea基因，另2株（2/4，50.0%）檢出sed基因；黃油樣品中有2株分離株（2/2，100.0%）檢出seb基因。

表3 多重PCR檢測(cè)SEs編碼基因結(jié)果 （株）

（三）金黃色葡萄球菌分離株耐藥性試驗(yàn)結(jié)果金黃色葡萄球菌分離株的耐藥性試驗(yàn)結(jié)果見表4。如表4所示，金黃色葡萄球菌分離株對(duì)青霉素G（90.7%）和四環(huán)素（47.5%）的耐藥率最高。所有金黃色葡萄球菌分離株均對(duì)慶大霉素、阿米卡星、氯霉素、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶和新生霉素敏感。同時(shí)，觀察到金黃色葡萄球菌分離株對(duì)頭孢西丁（16.0%）、氧氟沙星（16.0%）、諾氟沙星（16.0%）、桿菌肽（4.8%）、紅霉素（2.4%）、妥布霉素（2.4%）、螺旋霉素（1.2%）、林可霉素（1.2%）、克林霉素（1.2%）、卡那霉素（1.2%）、新霉素（1.2%）、磷霉素（1.2%）和夫西地酸（1.2%）的耐藥率較低。

表4 金黃色葡萄球菌分離株的抗菌藥物耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

三、討論

金黃色葡萄球菌是人類和動(dòng)物中常見的病原體，其被認(rèn)為是引起食源性中毒的重要原因之一。對(duì)于奶牛，金黃色葡萄球菌通常會(huì)使其患亞臨床乳腺炎，從而導(dǎo)致其產(chǎn)的牛奶受到污染[10]，繼而人在食用受污染的牛奶后可能產(chǎn)生中毒癥狀。金黃色葡萄球菌腸毒素可能形成于牛奶生產(chǎn)的多個(gè)程序過程中，例如將有腸毒素存在的乳汁混合到正常牛奶中、巴氏殺菌之前和（或）之后的污染以及冷卻過程的錯(cuò)誤操作等[11]。此外，奶酪生產(chǎn)鏈中的錯(cuò)誤操作、熱處理不當(dāng)以及保存溫度和時(shí)間設(shè)定不正確等都是產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素的重要因素[12]。

金黃色葡萄球菌的檢測(cè)和鑒定引起了眾多研究者的關(guān)注。KARAHAN等[13]報(bào)告稱，從患有亞臨床乳腺炎的奶牛產(chǎn)的牛奶樣本中獲得了多株金黃色葡萄球菌分離株，通過多重PCR檢測(cè)從這些分離株中檢出一種或多種腸毒素基因（27/92，29.3%）。FOOLADI等[14]發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)樣品中有32%的乳制品（奶油18%、奶酪10%、牛奶4%）被金黃色葡萄球菌污染，同時(shí)PCR結(jié)果表明，15.6%的金黃色葡萄球菌分離株含有sea基因，9.3%含有seb基因，6.2%含有sea+seb基因。ERTAS等[15]報(bào)道了從土耳其安卡拉市場(chǎng)上銷售的奶酪中分離出41株產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌菌株，其中25%含有sea基因，4%含有seb基因，6%含有sec基因，5%含有sea+sec基因，1%含有sed基因。BULAJIC等[16]發(fā)現(xiàn)，在土耳其安卡拉市場(chǎng)銷售的100個(gè)奶酪樣品中，5%的受污染樣品中含有金黃色葡萄球菌。這些結(jié)果與本研究結(jié)果略有差異，這可能與奶酪生產(chǎn)技術(shù)不同，以及檢測(cè)的牛奶樣品是生牛奶還是巴氏殺菌過的牛奶有關(guān)。

有研究人員從奶酪樣品中分離出金黃色葡萄球菌852株，產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的流行率為7.3%[17]。日本研究人 員KATSUDA等[18]在270株金黃色葡萄球菌分離株中，發(fā)現(xiàn)有183株（67.8%）含有一種或多種SEs基因。意大利科學(xué)家MORANDI等[19]報(bào)告稱，從牛奶和乳制品中分離出的67%的金黃色葡萄球菌菌株含有SEs基因。NORMONNO等[20]報(bào)道了從乳制品中分離出的125株（59.8%）產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的腸毒素基因型。GUCUKOGLU等[21]在16種（16.8%）水果冰淇淋和2種（6.6%）香草冰淇淋中發(fā)現(xiàn)了CPS，并獲得了16株產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的腸毒素基因型，包括9%sea基因、3%sea+seb基因、2%sea+sed基因、1%sec+sed基 因 和1%sea+seb+sec基因。這些結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

四、結(jié)論

本研究對(duì)244個(gè)生乳和乳制品樣品中產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在128個(gè)凝固酶陽性葡萄球菌陽性樣品中檢測(cè)到204株凝固酶陽性葡萄球菌。同時(shí)，采用多重PCR檢測(cè)了SEs編碼基因sea、seb、sec和sed。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生 牛 奶 樣 品 中 有14株 分 離 株 （14/102，13.7%）檢出SEs編碼基因，其中10株檢出sea基因，2株檢出seb基因，2株檢出sea+seb基因；白奶酪樣品中有8株分離株（8/42，19.0%）檢出SEs編碼基因，其中各有2株分離株檢出sea、sec、sed和sea+sed基因；馬蘇里拉奶酪樣品中有4株分離株（4/8，50.0%）檢出SEs編碼基因，其中2株檢出sea基因，另2株檢出sed基因；黃油樣品中有2株分離株（2/8，25.0%）檢出seb基因。使用盤擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些樣品中的金黃色葡萄球菌分離株對(duì)青霉素G和四環(huán)素的耐藥率最高。