翟榮啟 張凱歌 劉廣洋 黃曉冬 陳 鴿 徐東輝

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100081）

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題關(guān)系到人民的生命健康，為了減少農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事件的發(fā)生，開發(fā)準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)測(cè)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義[1]。目前市場(chǎng)上的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要分為兩大類，一類是以氣相色譜、液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用為主的確證檢測(cè)技術(shù)，另一類是以酶抑制法、酶聯(lián)免疫法、適配體檢測(cè)法為主的快速檢測(cè)技術(shù)[2]。確證檢測(cè)技術(shù)具有穩(wěn)定性高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但也具有成本高、耗時(shí)長、操作復(fù)雜等缺陷，不能滿足我國鮮活農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的檢測(cè)需求。因此，操作簡便、成本低、耗時(shí)短的酶抑制法和酶聯(lián)免疫法等快速檢測(cè)技術(shù)受到眾多研究學(xué)者的青睞[3]。

酶抑制法和酶聯(lián)免疫法中最常應(yīng)用的酶為天然生物酶[3～4]。天然生物酶是一類重要的生物催化劑，絕大多數(shù)的天然生物酶由蛋白質(zhì)組成，因其在高溫、過高或過低pH等環(huán)境中極易降低或者喪失催化活性，對(duì)環(huán)境的耐受性較差，致使應(yīng)用該類生物酶的檢測(cè)分析技術(shù)的準(zhǔn)確性受到影響[5]。為了彌補(bǔ)天然生物酶耐受性差等缺陷，研究人員開發(fā)出具有環(huán)境耐受性高、適用性廣、制備過程簡單和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)的納米酶。近年來，納米酶在農(nóng)業(yè)污染物檢測(cè) （如農(nóng)藥、重金屬、真菌毒素檢測(cè)）[6]、醫(yī)療診斷[7]、抗菌治療[8]等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。本文從酶催化反應(yīng)的角度對(duì)納米酶進(jìn)行分類，并闡述了不同種類納米酶的催化機(jī)理，為納米酶在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

一、納米酶及其催化機(jī)理

納米酶是一類既有納米材料的獨(dú)特性能，又有催化功能的模擬酶。自2007年YAN等首次發(fā)現(xiàn)磁性四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子具有過氧化物酶活性以來，越來越多的納米材料被證明具有催化活性[9]。在農(nóng)產(chǎn)品快速檢測(cè)領(lǐng)域，納米酶按活性主要分為氧化酶和過氧化物酶兩類。納米酶的催化活性隨尺寸大小、形貌結(jié)構(gòu)、表面修飾和活性位點(diǎn)的變化而變化。通過調(diào)節(jié)納米酶尺寸大小和活性位點(diǎn)、改變納米酶形貌結(jié)構(gòu)和表面修飾，可實(shí)現(xiàn)納米酶催化活性的精準(zhǔn)調(diào)控[10]。因此，探明納米酶催化反應(yīng)機(jī)理對(duì)精準(zhǔn)調(diào)控納米酶的催化活性具有重要意義。

過去的20年中，越來越多的納米材料被證明具有催化活性，然而對(duì)許多納米酶的催化機(jī)理缺乏深入研究[11]。筆者從納米酶活性分類的角度對(duì)納米酶的催化機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)概括。

（一）氧化酶氧化酶作為重要的酶類之一，其反應(yīng)機(jī)理是在分子氧（O2）的存在下催化底物的氧化。氧化酶可以根據(jù)催化底物的類型對(duì)其進(jìn)一步分類，如葡萄糖氧化酶、亞硫酸氧化酶等[12]。目前，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鉬基、金基、鈰基等納米酶具有氧化酶活性[13～15]。

金納米粒子（AuNPs）是具有葡萄糖氧化酶活性的納米酶，其反應(yīng)機(jī)理最早由ROSSI等提出。具體反應(yīng)原理是在堿性條件下，葡萄糖分子與OH－作用生成水合葡萄糖陰離子，水合葡萄糖陰離子與AuNPs表面相互作用，生成表面富電子的AuNPs，其親核攻擊分子氧，實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖陰離子到O2的電子轉(zhuǎn)移，從而生成葡萄糖酸和H2O2。在此過程中，AuNPs作為水合葡萄糖陰離子與O2之間電子轉(zhuǎn)移的橋梁[16]。為了進(jìn)一步證明納米酶具有氧化酶催化活性，HAYAT等[17]探究了氧化鈰對(duì)多巴胺的氧化反應(yīng)，證明了氧化鈰納米酶具有氧化酶活性。此外，CHEN等[18]首次發(fā)現(xiàn)氧化亞銅納米粒子（Cu2ONPs）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子底物細(xì)胞色素c（Cytc）的催化，反應(yīng)過程中Cu2ONPs主要作為電子轉(zhuǎn)移的載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的氧化（見圖1）。

圖1 氧化亞銅納米酶模擬細(xì)胞色素c氧化酶示意

以上具有氧化酶活性的納米酶，其主要催化機(jī)理是納米酶作為電子轉(zhuǎn)移的橋梁，實(shí)現(xiàn)了電子從氧化劑到還原劑的轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)氧化還原反應(yīng)的催化作用。

（二）過氧化物酶過氧化物酶可以分解各種過氧化物（ROOH、H2O2）來氧化底物。常見的過氧化物酶有辣根過氧化物酶（HRP）、細(xì)胞色素c過氧化物酶等[19]。

普魯士藍(lán)化學(xué)式為Fe4［Fe（CN）6］3，其是一種鐵基納米材料。ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)Fe4［Fe（CN）6］3納米粒子并非是由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，而是抑制羥基自由基的產(chǎn)生。在酸性條件下，H2O2將Fe4［Fe（CN）6］3納米粒子氧化為柏林綠或普魯士黃，反應(yīng)底物的電子通過柏林綠或普魯士黃轉(zhuǎn)移到H2O2，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的氧化。此外，五氧化二釩（V2O5）納米酶通常表現(xiàn)出釩鹵過氧化物酶模擬活性[21]。

過氧化氫酶屬于過氧化物酶的一種，其可以將過氧化氫分解為水和氧氣，在化工、食品、環(huán)境檢測(cè)方面有重要的作用。金屬基納米材料、金屬氧化物納米材料和普魯士藍(lán)等都表現(xiàn)出類過氧化氫酶的性質(zhì)。過氧化氫酶可以利用過氧化氫將RH2（酚、醛、醇等）氧化，當(dāng)過氧化氫的濃度過高時(shí)，過氧化氫酶可以將過氧化氫進(jìn)一步分解為水和氧氣[22]。

WANG等[23]討論了Fe3O4磁性納米粒子（Fe3O4MNPs）作為過氧化氫酶的催化機(jī)理，以Fe3O4MNPs催化羅丹明B（RhB）降解為例，F(xiàn)e3O4MNPs的表面吸附大量的H2O2，然后被其表面的Fe2+和Fe3+激活，生成·OH和·O2－/HO2·自由基催化RhB的降解（見圖2）。

圖2 Fe3O4納米酶模擬過氧化氫酶的反應(yīng)原理示意

此外，ZHAO等[24]發(fā)現(xiàn)羰基納米酶具有類過氧化氫酶活性，其催化機(jī)理也是通過自由基機(jī)理進(jìn)行的。該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了多種結(jié)構(gòu)的羰基納米酶，發(fā)現(xiàn)大型芳香族結(jié)構(gòu)域?qū)︳驶{米酶的過氧化氫酶活性具有重要作用。由于羰基納米酶模擬過氧化氫酶的催化活性來源于其催化H2O2產(chǎn)生·OH自由基的能力，因此，HUANG等[25]采用熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)羰基納米酶與H2O2相互作用的產(chǎn)物，證明了羰基納米酶模擬過氧化氫酶的催化機(jī)理中酮羰基是作為催化的活性位點(diǎn)，羧基是作為底物的結(jié)合位點(diǎn)，完成對(duì)底物的催化。綜上可以看出，具有類過氧化氫特性的納米酶反應(yīng)機(jī)理主要是由納米酶表面與H2O2相互作用產(chǎn)生·OH自由基，之后進(jìn)一步與底物發(fā)生反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的催化[26～27]。

二、納米酶在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用

相較于天然生物酶，由于納米酶具有易制備、成本低、穩(wěn)定性好、粒徑可控、比表面積大、活性可調(diào)控等多種優(yōu)勢(shì)，受到許多研究學(xué)者的青睞。近年來，納米酶被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域。筆者將相關(guān)研究文獻(xiàn)中應(yīng)用納米酶檢測(cè)農(nóng)藥、真菌毒素、金屬離子的催化機(jī)理、基質(zhì)、線性范圍、檢測(cè)限等情況進(jìn)行了整理匯總（見表1）。

表1 納米酶在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

（一）氧化酶氧化酶在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素殘留快速檢測(cè)中起到重要的作用[13～15]。HUANG等[32]利用具有氧化酶活性的復(fù)合氧化物MnCo2O4納米酶構(gòu)建的比色方法檢測(cè)玉米中的赭曲霉毒素A（OTA），MnCo2O4納米酶的Km值比HRP高50倍，表明MnCo2O4納米酶對(duì)底物的親和力高于HRP，并且MnCo2O4納米酶無需H2O2參與反應(yīng)，提高了方法的穩(wěn)定性，證明了MnCo2O4納米酶相較于HRP更適合生物傳感器的應(yīng)用。此外，TIAN等[33]利用堿性磷酸酶－二氧化錳（MnO2）類氧化酶串聯(lián)催化放大體系痕量檢測(cè)葡萄汁中的OTA（見圖3），發(fā)現(xiàn)MnO2的催化活性可以存在60 d，證明了MnO2納米酶的環(huán)境耐受性更強(qiáng)。LAI等[35]采用MnO2納米酶對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）進(jìn)行快速檢測(cè)，經(jīng)試驗(yàn)證明，在多種真菌毒素的干擾下，利用MnO2納米酶的檢測(cè)方法仍表現(xiàn)出了良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)物，檢出限遠(yuǎn)低于我國最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其線性范圍在0.05～150 ng/mL之間。

圖3 MnO2納米酶級(jí)聯(lián)比色傳感器檢測(cè)赭曲霉毒素A的反應(yīng)過程

（二）過氧化物酶二氧化鍺（GeO2）、氧化鎳（NiO）、金（Au）、鉑（Pt）等許多納米材料具有過氧化物酶的活性，在檢測(cè)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。過氧化物納米酶催化四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、鄰苯二胺等發(fā)光底物顯色，產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)，在農(nóng)藥、真菌毒素、金屬離子檢測(cè)等方面具有廣泛應(yīng)用。

1.農(nóng)藥檢測(cè)方面。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)，GUAN等[28]開發(fā)了turn－on模式的有機(jī)磷化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，其原理是乙硫磷和乙醇與Fe3O4納米粒子爭奪結(jié)合位點(diǎn)，抑制Fe3O4納米酶活性，降低化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度以實(shí)現(xiàn)對(duì)乙硫磷的檢測(cè)（見圖4）。上述實(shí)驗(yàn)過程中，F(xiàn)e3O4納米酶在酸性、有機(jī)溶劑等極端條件下仍具有良好的催化活性。此外，將具有過氧化物酶活性的納米酶的催化特性與比色檢測(cè)方法結(jié)合，可用來檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。GeO2納米顆粒具有過氧化物酶的催化活性，可催化TMB顯色，利用其特性構(gòu)建的GeO2－乙酰膽堿酯酶（AChE）反應(yīng)體系能準(zhǔn)確地檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中對(duì)氧磷[30]。GeO2納米酶 在pH 4.0～7.0范圍內(nèi)可保持95%以上的相對(duì)活性，在50℃內(nèi)可保持90%以上的相對(duì)活性，在90℃下仍保持約50%的原始活性，證明了GeO2納米酶具有良好的穩(wěn)定性。有研究表明，鈀（Pd）－Au納米酶也具有過氧化物酶的活性，通過催化H2O2氧化使底物鄰苯二胺顯色，結(jié)合馬拉硫磷對(duì)Pd－Au納米酶活性的抑制作用，構(gòu)建了馬拉硫磷比色檢測(cè)方法[31]。利用Pd－Au納米酶通過電化學(xué)和熒光標(biāo)記物結(jié)合，分別構(gòu)建的電化學(xué)傳感器[40]和熒光傳感器[36]，被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全檢測(cè)中。

圖4 類過氧化氫酶活性的Fe3O4納米酶檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的反應(yīng)原理示意

具有類過氧化物酶活性的納米酶也被用于修飾電極，增強(qiáng)傳感器的靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥的檢測(cè)。KHAIRY等[6]開發(fā)的用氧化鎳（NiO）納米酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有較強(qiáng)的吸附作用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種樣品中對(duì)硫磷殘留的快速測(cè)定，檢測(cè)限可達(dá)24 nmol/L。

2.真菌毒素檢測(cè)方面。真菌毒素在食品安全案例中被廣泛關(guān)注，為了降低真菌毒素帶來的風(fēng)險(xiǎn)，科研人員開發(fā)出類過氧化物活性的納米酶的比色傳感器用于真菌毒素檢測(cè)。此類傳感器對(duì)TMB具有良好的催化活性，促使TMB顯色，此時(shí)加入真菌毒素－適配體可以使納米酶表面活性位點(diǎn)被屏蔽，抑制其催化作用，減弱TMB顯色。若待測(cè)樣品中存在真菌毒素，便會(huì)與適配體結(jié)合，從納米酶上脫落，納米酶催化活性恢復(fù)，TMB再次顯色?；贏uNPs－H2O2－TMB催化體系的玉米赤霉烯酮（ZEN）比色檢測(cè)方法也采用了上述原理[34]。

3.金屬離子檢測(cè)方面。具有類過氧化物酶性質(zhì)的納米酶在金屬離子的快速檢測(cè)中發(fā)揮了巨大作用。對(duì)金屬離子的檢測(cè)也是通過建立比色傳感器來實(shí)現(xiàn)的，不同金屬離子對(duì)類過氧化物酶的納米酶的催化活性不同。在AuNPs表面修飾降低催化活性的K+適配體后[36]，可以使其負(fù)電荷密度增強(qiáng)，而催化底物TMB帶有正電荷，兩者之間親和力增強(qiáng)，TMB顯色增強(qiáng)。當(dāng)待測(cè)物中存在K+時(shí)，金屬離子會(huì)與適配體優(yōu)先結(jié)合，AuNPs和適配體之間不再進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，類過氧化物酶的納米酶催化活性下降，實(shí)現(xiàn)對(duì)K+的快速檢測(cè)。其測(cè)定的線性范圍為0.1～1 000 nmol/L，檢出限（LOD）可達(dá)到0.06 nmol/L，證明了AuNPs納米酶具有良好的催化活性。ZHANG等[37]采用組氨酸（His）修飾的鈀納米粒子檢測(cè)Ag+，使其對(duì)H2O2－TMB顯色的催化作用得到提高。將Ag+加入上述體系，His會(huì)與納米酶分離，Ag+與His之間存在強(qiáng)相互作用，使得鈀納米酶催化活性降低，在30～300 nmol/L的線性范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高靈敏度地測(cè)定Ag+，檢測(cè)限低至4.7 nmol/L。除此以外，研究發(fā)現(xiàn)Fe2+具有提高納米酶類過氧化物酶催化活性的作用[39]，結(jié)合類過氧化物酶納米酶制備的比色傳感器簡單、靈敏度高且響應(yīng)快，對(duì)金屬離子的選擇具有特異性。

上文中研究人員基于不同納米酶模擬酶的反應(yīng)機(jī)理，結(jié)合檢測(cè)物質(zhì)和基質(zhì)的性質(zhì)，從反應(yīng)機(jī)理角度去設(shè)計(jì)和修飾納米酶，從而提高了檢測(cè)靈敏度和結(jié)果可靠性。此外，納米酶因其具備的催化特性，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。

三、結(jié)論與展望

近20年來，許多納米材料的催化活性被發(fā)掘，其中包括金屬基納米酶、金屬氧化物或硫化物納米酶、羰基納米酶。納米酶以優(yōu)異的催化活性、良好的穩(wěn)定性、活性可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、傳感器法等檢測(cè)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥、真菌毒素、金屬離子等物質(zhì)的快速檢測(cè)，不僅獲得了良好的靈敏度、檢出限，而且在一定程度上克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷。

雖然納米酶的應(yīng)用已經(jīng)取得較大的發(fā)展，但是對(duì)納米酶催化機(jī)理的研究仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。首先，納米酶的材料來源廣泛，不同材料的納米酶可能具備相同的模擬酶活性，但其催化機(jī)理完全不同。其次，納米酶表面結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性，不同納米酶的異質(zhì)組成和表面結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致了納米酶催化機(jī)理的復(fù)雜性。對(duì)納米酶的研究目前仍處于初級(jí)階段，其應(yīng)用于樣品目標(biāo)物的檢測(cè)仍處于實(shí)驗(yàn)室階段的理論研究，對(duì)于其商品化應(yīng)用到實(shí)際樣品中檢測(cè)仍有很多的研究工作需要開展。未來納米酶的設(shè)計(jì)和發(fā)展或朝著以下幾個(gè)方向：一是多元設(shè)計(jì)新型納米酶；二是精準(zhǔn)調(diào)控納米酶的催化活性；三是全面闡明納米酶催化機(jī)理；四是深入開發(fā)納米酶特異性識(shí)別功能?？偨Y(jié)來說，納米酶在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用前景廣闊，更多未知納米酶亟需被發(fā)現(xiàn)，納米酶的研究開發(fā)任重而道遠(yuǎn)。