趙方毓，覃曉莉，何一多，王鳳杰，唐鮮娥，彭新鑫，陳顯兵*

(1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院 病理科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)部， 湖北 恩施 445000；3.湖北恩施學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是各種外界因素導(dǎo)致的脊髓組織不同程度的急性損傷，可引起損傷平面以下的軀體感覺、運動功能障礙。自損傷開始，SCI經(jīng)歷原發(fā)性損傷、繼發(fā)性損傷及損傷慢性期等階段。繼發(fā)性損傷可逆、可控，其病理過程影響著SCI的病程發(fā)展，其中細(xì)胞自噬(autophagy) 在該階段的作用是目前較為熱門的研究內(nèi)容[1]。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的主要成分，死亡后無法再生，因此在繼發(fā)性損傷期保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少神經(jīng)元凋亡是治療的核心問題[2-4]。蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)為筒鞘蛇菰的提取物，研究表明，BPS具有良好清除自由基、抗氧化、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用[5]。已證實BPS具有拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的肝損傷作用[6-7]。目前尚無BPS在神經(jīng)損傷中藥效的研究和報道。本實驗通過構(gòu)建急性脊髓損傷模型大鼠，旨在探討B(tài)PS對脊髓挫傷的治療作用和機(jī)制，為藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要材料與試劑：蘇木精、伊紅染料盒尼氏染色液，BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、PBS緩沖液和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔和抗小鼠IgG 抗體(二抗)、β 肌動蛋白抗體(一抗)和LC3A/B 兔源單克隆抗體(一抗)(Santa Cruz公司)；SQSTM1/p62抗體(一抗)(Abcam公司)；BECN 1抗體(Cell Signaling Technology公司)；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Thermo公司)。

SPF級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量120～150 g，湖北省實驗動物研究中心，許可證號:[SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

蛇菰多糖的提取與純化：筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)經(jīng)湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗檢測中心鑒定。洗凈烘干、搗碎成粗粉。75%乙醇浸泡蛇菰粗粉24 h后離心去溶劑，粉末再次干燥。再按蛇菰粗粉/去離子水為1/10的比例將蛇菰粗提取物反復(fù)浸泡、煮沸、離心并收集上清液，2～3遍。合并上清液行減壓濃縮至1 L。所得濃縮液加入無水乙醇，低溫靜置過夜再次離心分離沉淀。沉淀以水溶解后再次離心除去不溶物，濾液減壓濃縮后再加入無水乙醇洗滌3次，50 ℃烘干，得純蛇菰多糖。苯酚-硫酸法測得多糖含量為61.3%。

大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術(shù)組(sham，n=10)、模型組(SCI，n=15，用改良Allen’s脊髓撞擊法[8])、BPS干預(yù)組(BPS,n=45)。BPS組再分低、中、高3個劑量組，于術(shù)后2 h開始每天分別用25、50和100 mg/kg的BPS(n=15/組)灌胃14 d。

BBB評分評估運動功能：脊髓損傷后采用雙盲法、隔日對各組大鼠進(jìn)行Basso、Beattie，Bresnahan (BBB)運動測評，以評估后肢運動功能恢復(fù)情況。每天觀察3次，每次時間為5 min，以3個記錄數(shù)據(jù)的均值進(jìn)行統(tǒng)計。根據(jù)BBB評分的多少可以將脊髓組織損害程度等級分為6個級別：A(0分)為完全性損害；B(1～7分)為重度損傷；C(8～14分)為中度損傷；D(15～18分)為輕度損傷；E(19～20分)為輕微損傷；F(21分)為正常[9]。

HE及尼氏染色法檢測形態(tài)學(xué)：取大鼠損傷段脊髓(T9～T11)行HE及尼氏染色，觀察脊髓損傷和神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量，分布等情況。

Western blot 檢測Beclin 1、LCS Ⅱ、p62、β-actin等蛋白表達(dá)：提取損傷段脊髓組織總蛋白。按既定程序行SDS-PAGE電泳、蛋白印記轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉、PBS洗膜后一抗(β-actin，1∶1 000；LC3A/B，1∶1 000；BECN 1，1∶800；SQSTM1/p62，1∶800)4 ℃孵育過夜。次日PBS洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的二抗(IgG，1∶5 000) 37 ℃孵育4 h，再次PBS洗膜3次。最后采用化學(xué)發(fā)光法檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)。數(shù)據(jù)結(jié)果以目標(biāo)蛋白/β-actin的吸光度值來分析蛋白的相對表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SCI大鼠運動功能的評估

sham組的BBB評分正常。SCI組評分-時間曲線明顯低于sham組，第14日仍為重度損傷(P<0.05)。BPS組評分增長曲線呈劑量依賴性高于SCI組(圖1)。

2.2 大鼠脊髓組織的形態(tài)變化

SCI組大鼠的脊髓背側(cè)白質(zhì)和中央灰質(zhì)均有嚴(yán)重?fù)p傷：組織呈現(xiàn)海綿狀，出現(xiàn)廣泛水腫、細(xì)胞壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)見空洞形成。低劑量BPS組第14天的脊髓形態(tài)改善不明顯，中、高劑量BPS組脊髓結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞水腫及壞死減輕，空洞面積明顯減少(圖2)。

the relative change of BBB scores-time curve; *P< 0.05 compared with sham group on day 14; #P<0.05 compared with SCI group on day 14圖1 脊髓損傷后各組大鼠BBB評分評估神經(jīng)功能Fig 1 Neurological function evaluated by the BBBscores after spinal cord injury

與sham組相比，SCI組的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體結(jié)構(gòu)不完整，顏色淺淡，組織炎性反應(yīng)較重。BPS組神經(jīng)元數(shù)量比SCI組增多，胞體較大，結(jié)構(gòu)相對完整，尤其是中、高劑量BPS組的神經(jīng)元數(shù)量和胞體結(jié)構(gòu)較SCI組有所改善。

A.hematoxylin-eosin staining on day 14(×40)；B.Nissl staining on day 14(×400); arrow showed positive cell圖2 各組大鼠治療第14天脊髓形態(tài)學(xué)改變Fig 2 Hemorphological changes of spinal cord on day 14 of each group

2.3 各組大鼠脊髓組織自噬標(biāo)記蛋白的表達(dá)變化

與sham相比，SCI組LC3 Ⅱ表達(dá)上調(diào)，第7日表達(dá)最高(P<0.05)，而Beclin 1表達(dá)下降，于第7天表達(dá)最低(P<0.05)。另外，自噬降解底物p62在SCI發(fā)生后表達(dá)持續(xù)增加，于第7天表達(dá)最高(P<0.05)(圖3A)。

與SCI相比，BPS組Beclin 1和LC3-Ⅱ在第7、14天均表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，同時自噬降解底物p62的表達(dá)下降(P<0.05)。上述蛋白的相對變化水平隨BPS劑量的增加而更加明顯(圖3B)。

A.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in sham and SCI groups; B.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in SCI and BPS groups; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with SCI group

3 討論

自噬是脊髓損傷后發(fā)生改變的細(xì)胞過程之一[10]。細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白、功能失調(diào)的細(xì)胞器可通過這一高度保守的溶酶體依賴性過程進(jìn)行清除。自噬是一個復(fù)雜動態(tài)過程，從自噬信號啟動、形成自噬小體、自噬體與溶酶體融合至分子降解以及再利用稱為自噬能通量[11]。通量的破壞會導(dǎo)致受損細(xì)胞內(nèi)損傷細(xì)胞器和異常蛋白的蓄積,從而干擾細(xì)胞的功能，并可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[11-12]。作為終末分化性細(xì)胞，神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的自噬對自身質(zhì)量控制十分重要[13]。在SCI患者中，挫傷性損傷患病率極高。本研究以大鼠脊髓挫傷為疾病模型，對SCI進(jìn)程中的自噬過程進(jìn)行初步探索，發(fā)現(xiàn)在亞急性期(損傷7 d)自噬體的形成(LC3 Ⅱ/Ⅰ)逐漸增加，但負(fù)性蛋白p62并沒有下降，而是升高。同時在此階段出現(xiàn)自噬啟動不足,提示自噬能通量在SCI進(jìn)程中存在異常。這與既往的研究結(jié)果[14-15]一致。目前尚不清楚這一異常自噬活動的機(jī)制。

大量研究報道了BPS在肝損傷、疲勞等方面的拮抗作用，但是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚，本研究證實了3種劑量的BPS均具有抗脊髓損傷、促進(jìn)功能恢復(fù)的作用，尤其是在亞急性BPS功能改善作用更明顯。 盡管細(xì)胞自噬在SCI繼發(fā)性損傷階段是一個非常重要的病理過程，但當(dāng)存在自噬能通量異常時，會加重神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙，甚至最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。BPS可以增強(qiáng)損傷組織中的自噬啟動，降低負(fù)性蛋白的表達(dá)，表明BPS可以通過調(diào)節(jié)自噬能通量這一途徑拮抗脊髓損傷。

綜上所述，本研究證實了筒鞘蛇菰活性提取物BPS可以改善大鼠脊髓損傷后的運動功能障礙，通過增強(qiáng)損傷組織中的自噬啟動，降低負(fù)性蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)自噬能通量異常等途徑來保護(hù)神經(jīng)，拮抗損傷。本研究為臨床應(yīng)用保護(hù)神經(jīng)功能的用藥及BPS藥物的開發(fā)提供一定的依據(jù)。