梁 冰,嚴(yán)玉蘭
(1.昆山市中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科,江蘇 昆山 215300; 2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 呼吸科,江蘇 鎮(zhèn)江 212000)
小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是惡性程度較高的惡性腫瘤之一,雖然目前免疫治療對(duì)其部分有效,但很多患者因經(jīng)濟(jì)原因或其不良反應(yīng)而無(wú)法耐受免疫治療。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是最常見(jiàn)且最具潛力的溶瘤病毒之一[1]。NDV可以選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞,因它在癌細(xì)胞中復(fù)制效率是正常細(xì)胞的10 000倍[2]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)重組新城疫病毒rL-RVG[3]能夠抑制肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖,并有促凋亡作用[4],而且rL-RVG能夠影響A549細(xì)胞系的遷移及活動(dòng)減弱[5],但rL-RVG對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446的作用機(jī)制不詳,本實(shí)驗(yàn)主要探討rL-RVG對(duì)SCLC細(xì)胞增殖及遷移的影響。
NDV LaSota系、rL-RVG(哈爾濱獸醫(yī)研究所);人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446(上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù));胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(維森特生物技術(shù)有限公司);HRP-兔抗雞二抗(Earthox公司);FITC-山羊抗鼠二抗、Cy3-山羊抗雞二抗(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司);兔抗E-cadherin、兔抗MMP2 抗體(博士德生物工程有限公司);核熒光染料(Hoechst33342)、MTT(Sigma-Aldrich公司)。
1.2.1 免疫熒光法檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá):將NCI-H446細(xì)胞接種在高溫滅菌后的蓋玻片上,將蓋玻片放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng),加入稀釋好的rL-RVG及NDV病毒液,恒溫箱過(guò)夜,洗滌,固定,再洗滌,封閉,加入雞抗NDV(1∶150)一抗或小鼠抗狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)(1∶100)一抗,加入Cy3-山羊抗雞(1∶300)二抗或FITC-山羊抗鼠(1∶100)二抗,細(xì)胞核用0.2 μmol/L Hoechst 33342作用30 min,封片。于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的標(biāo)志物:FITC(綠色)、Cy3(紅色)和Hoechst 33342(藍(lán)色)。
1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:rL-RVG及NDV病毒液的滴度在雞胚半數(shù)感染量為109.8EID50/mL[3-5]。將rL-RVG和NDV用DMEM培養(yǎng)基(不含血清)稀釋至10-1、10-2、10-3和10-4濃度,將增殖期的NCI-H446細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿,100 μL/孔,在rL-RVG組及NDV組分別加入相應(yīng)的病毒稀釋液,PBS組為陰性對(duì)照組[4],詳細(xì)過(guò)程見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[4-5]:細(xì)胞活力值=(實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值) ×100%。
1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]中方法進(jìn)行細(xì)胞處理,用無(wú)菌200 μL槍頭在細(xì)胞層中縱向劃線,將PBS、NDV(10-3稀釋度)、rL-RVG(10-3稀釋度)分別感染細(xì)胞24 h,光鏡下觀察劃痕寬度。
1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:在24孔板的Transwell上室內(nèi)每孔加入100 μL增殖期NCI-H446細(xì)胞懸液,下室分別加入含rL-RVG(10-3稀釋度)、NDV(10-3稀釋度)的DMEM液600 μL,對(duì)照組加入DMEM液600 μL,37 ℃培養(yǎng)1 d,擦去Transwell上室聚碳酸酯膜表面的細(xì)胞,沖洗后用4%多聚甲醛固定上室細(xì)胞15 min,再次沖洗后用結(jié)晶紫染色20 min,選取5個(gè)不同視野,在倒置熒光顯微鏡下(×200)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞,求平均值。
1.2.5 免疫熒光法檢測(cè)遷移途徑:按照1.2.1實(shí)驗(yàn)步驟處理rL-RVG組、NDV組和對(duì)照組,后加入E-cadherin、MMP2一抗及對(duì)應(yīng)的二抗,加核熒光抗體后在熒光顯微鏡下觀察。
在熒光顯微鏡下可見(jiàn),RVG蛋白及NDV蛋白均可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),NDV熒光蛋白表達(dá)量在rL-RVG組較NDV組多(圖1)。
圖1 rL-RVG和NDV感染NCI-H446細(xì)胞24 h后RVG蛋白及NDV蛋白的表達(dá)
rL-RVG病毒液及NDV病毒液被稀釋成不同濃度,rL-RVG和NDV均對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用;病毒濃度越高,對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng);rL-RVG對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于NDV(P<0.05)(圖2)。
*P< 0.05 compared with NDV group圖2 不同濃度的rL-RVG和NDV對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of rL-RVG and NDV at different solubilities on cell proliferation of NCI-H446
rL-RVG、NDV及PBS感染細(xì)胞劃痕后24 h,細(xì)胞的遷移距離分別為(465±40)μm、(739±7)μm及(1 505±13)μm,rL-RVG組細(xì)胞遷移距離顯著小于NDV組及對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。
rL-RVG組及NDV組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。
相較于對(duì)照組及NDV組,MMP2的熒光強(qiáng)度在rL-RVG組中減弱(P<0.05),而E-cadherin 熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)(圖5)。
小細(xì)胞肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是其治療失敗的原因之一,嚴(yán)重影響患者的治療效果。新城疫病毒(NDV)隸屬禽副黏病毒屬,是一種主要感染禽類的雞瘟病毒[1]。根據(jù)NDV在禽類中的致病性,可以被分為3個(gè)主要致病型:低毒株、中毒株和強(qiáng)毒株, 其中NDV LoSata系是低毒株, 亦是本實(shí)驗(yàn)選其的原因之一。有臨床試驗(yàn)表明NDV野生株在各種實(shí)體腫瘤治療中未見(jiàn)明顯的不良反應(yīng)[6],rL-RVG具有安全、高免疫活性、穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rL-RVG能在NCI-H446細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,并且NDV熒光蛋白表達(dá)量在rL-RVG組中較NDV LaSota組多。在劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室法中,rL-RVG明顯抑制NCI-H446細(xì)胞的遷移,較NDV作用強(qiáng)。細(xì)胞遷移是惡性腫瘤侵襲和遷移的關(guān)鍵步驟之一[5,7],上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5,8]。參與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子有MMP2和E-cadherin。MMP2在細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用,其降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),與腫瘤上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。MMP2在SCLC中表達(dá)較高[11]。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白,參與細(xì)胞與細(xì)胞間黏附,可以激活鈣黏蛋白,促進(jìn)橋粒連接形成,能夠參與維持細(xì)胞的極性和完整性[5,8]。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生與E-cadherin的異常表達(dá)直接相關(guān),在癌侵襲中起著重要作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn),rL-RVG感染NCI-H446后影響MMP2及E-cadherin的表達(dá),從而抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移。
圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rL-RVG和NDV對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移的影響Fig 3 Effect of rL-RVG and NDV on migration of NCI-H446 cells detected by scratch test(×40)
arrow pointed to NCI-H446 cells; *P< 0.05 compared with control group
A:immunofluorescence analysis of MMP2 and E-cadherin protein expression: a-c.MMP2 of PBS,NDV and rL-RVG group,respectively, d-f.E-cadherin of PBS,NDV and rL-RVG group,respectively; B:single cell fluorsence intensity of MMP2, *P<0. 05 compared with control and NDV group; C:single cell fluorsence intensity of E-cadherin,*P<0. 05 compared with control and NDV group