呂 雄，仇靈江，勞洵姬，談偉強

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院 整形外科，浙江 杭州 310020；2.溫州醫(yī)科大學附屬衢州醫(yī)院(衢州市人民醫(yī)院)醫(yī)療美容科， 浙江 衢州 324000；3.浙江省臺州醫(yī)院 整形美容科，浙江 臺州 317099)

瘢痕疙瘩(keloid，KD)是一種良性皮膚纖維增生性腫瘤，通常是易感個體傷口異常愈合的結(jié)果，為人類獨有[1]。KD可進行性生長，不斷侵蝕周邊正常組織，其特征為成纖維細胞(fibroblasts，F(xiàn)B)的過度增殖和膠原纖維的異常沉積[2]。長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)與人類多種疾病進展密切相關。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號異常高活化與KD的發(fā)生和發(fā)展有關，下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β激活的lncRNA(lncRNA activated by transforming growth factor-β，lncRNA-ATB)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFB)中TGF-β2的自分泌[3]。但lncRNA-ATB在KFB增殖和膠原合成中的作用還尚未可知。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路涉及轉(zhuǎn)移、發(fā)育和凋亡等生物過程[4]。阿司匹林可有效抑制KFB中的NF-κB信號通路活化來誘導細胞凋亡[5]。這表明NF-κB信號通路在KD中可能發(fā)揮重要作用。本實驗旨在研究lncRNA-ATB在KD中的作用以及其是否可通過調(diào)控NF-κB信號通路而影響KFB的增殖和膠原合成。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol試劑及反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay， RIPA)蛋白裂解液及二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；si-NC及si-lncRNA-ATB(上海吉瑪制藥公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)、p-p65和p-IκBα抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:KFB和人正常成纖維細胞(NFB)從浙江大學醫(yī)學院手術切除的KD中和健康人皮膚組織中收集。本研究已獲得單位倫理委員會批準及參與者知情同意。按照實驗方法[6]分離細胞，使用75%乙醇溶液浸泡后，經(jīng)過PBS沖洗3次，除去血管、皮膚表層等結(jié)締組織，在無菌條件下剪碎組織塊1 mm3，加入IV膠原酶試劑，1 200 r/min離心 5 min后棄上清，加DMEM培養(yǎng)基反復吹打，再次離心，PBS沖洗3次，于DMEM培養(yǎng)基中以37 ℃、5% CO2環(huán)境條件培養(yǎng)，每周換液2～3次，在細胞匯合度至70%時進行傳代。倒置顯微鏡下觀察細胞增生情況，取第5代細胞用于后續(xù)實驗。

將si-NC和si-lncRNA-ATB分別轉(zhuǎn)染至si-NC組和si-lncRNA-ATB組，未經(jīng)轉(zhuǎn)染的KFB為NC組。si-lncRNA-ATB+TNF-α組以TNF-α(20 ng/mL的NF-κB活化激活劑)處理轉(zhuǎn)染si-lncRNA-ATB的KFB。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000試劑盒說明進行。

1.2.2 RT-qPCR檢測lncRNA-ATB表達水平:提取各組KFB總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，lncRNA-ATB以β-actin為內(nèi)參，相對表達量采用2-△△Ct法計算。lncRNA-ATB上游引物序列：5′-TGGGATTCGATCAA CAGAGAGT-3′，下游引物序列：5′-CATACTGCCC CTCCCGTTTG-3′；β-actin上游引物序列：5′-CATGT ACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列：5′-CTCC TTAATGTCACGCACGAT-3′；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:將各組KFB(2×105個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)，培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液(20 μL/孔)，室溫孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(150 μL/孔)，室溫振蕩孵育5 min，酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A值)，即代表細胞活性。

1.2.4 Western blot檢測cyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-p65和p-IκBα蛋白的表達水平：提取各組KFB總蛋白，用BCA試劑盒定量。各組蛋白上樣量60 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，暗室中曝光顯影，定影。Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達量以其與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示。

1.2.5 流式細胞測量術檢測細胞周期:取對數(shù)增生期第3～6代細胞制成細胞懸液，以流式細胞儀檢測細胞周期分布，每個樣本重復5次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 人KFB中l(wèi)ncRNA-ATB的表達

與NFB(1.00±0.11)比較，KFB中l(wèi)ncRNA-ATB表達水平(2.38±0.21)升高(P<0.05)。

2.2 敲減lncRNA-ATB表達對KFB增殖的影響

與NC組比較，si-NC組lncRNA-ATB和cyclinD1表達水平、KFB細胞增殖以及G0/G1、S和G2期細胞百分比無顯著差異。與si-NC組比較，si-lncRNA-ATB組LncRNA-ATB表達水平顯著降低，cyclinD1表達水平、KFB細胞活力以及S期細胞百分比顯著降低，G0/G1期細胞百分比升高(P<0.05)(圖1,表1)。

2.3 敲減lncRNA-ATB表達對KFB膠原合成的影響

與NC組比較，si-NC組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達水平無顯著差異。與si-NC組比較，si-lncRNA-ATB組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達水平顯著降低(P<0.05)(圖2, 表2)。

A.cell cycle changes were detected by flow cytometry; B.expression of cyclinD1 protein was detected by Western blot圖1 敲減lncRNA-ATB表達抑制KFB周期進程以及相關蛋白的表達Fig 1 Knock-down of lncRNA-ATB expression inhibits KFB cycle progression and related protein expression

表1 敲減lncRNA-ATB表達抑制KFB的增殖及cyclinD1蛋白表達Table 1 Knock-down lncRNA-ATB expression inhibits KFB proliferation and cyclinD1 protein

圖2 Western blot檢測Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達Fig 2 The expression of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ proteins by Western blot

表2 敲減lncRNA-ATB表達抑制KFB的膠原合成

2.4 敲減lncRNA-ATB表達對人KFB中NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與NC組比較，si-NC組p-p65、p-IκBα表達水平無顯著差異。與si-NC組比較，si-lncRNA-ATB組p-p65、p-IκBα表達水平顯著降低(P<0.05)(圖3, 表3)。

2.5 TNF-α可減弱si-lncRNA-ATB對KFB增殖和膠原合成的抑制作用

與si-lncRNA-ATB組比較，si-lncRNA-ATB+TNF-α組p-p65、p-IκBα、cyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達水平、KFB細胞A值以及S期細胞百分比顯著升高，G0/G1期細胞百分比顯著降低(P<0.05)(圖4,表4)。

圖3 Western blot檢測p-p65和p-IκBα蛋白的表達Fig 3 The expression of p-p65 and p-IκBα proteins detected by Western blot

表3 敲減lncRNA-ATB表達對人KFB中NF-κB信號通路蛋白表達的影響

3 討論

KD來源的FB是KD組織的主要細胞成分，在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)如Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的合成和重塑中發(fā)揮關鍵作用，表明持續(xù)的侵襲性增生與膠原生成之間存在關聯(lián)[7]。由于KD的臨床表現(xiàn)以及病理學特征與腫瘤相似，因此，眾多研究將腫瘤的研究結(jié)果應用于KD的治療[8]。有研究報道lncRNA-ATB在人類多種癌中表達異常，可促進癌的發(fā)生發(fā)展。lncRNA-ATB在卵巢癌組織中表達升高，其高表達與患者的不良預后相關；沉默lncRNA-ATB表達可抑制卵巢癌細胞的增殖、 侵襲和遷移[9]。LncRNA-ATB在喉癌組織中表達增強，并與T分級和臨床分期有關，lncRNA-ATB高表達的總生存率明顯降低[10]。過表達lncRNA-ATB可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。沉默lncRNA-ATB表達可抑制膽管癌細胞活力，誘導細胞凋亡和G0/G1期阻滯[12]。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，與NFB比較，KFB中l(wèi)ncRNA-ATB表達水平升高，敲減lncRNA-ATB表達降低了KFB細胞活力、cyclinD1水平以及S期細胞百分比，升高了G0/G1期細胞百分比；降低了Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平。這表明，下調(diào)lncRNA-ATB表達可抑制KFB的增殖和膠原合成。

A.cell cycle changes were detected by flow cytometry; B.the expression of cyclinD1 protein was detected by Western blot圖4 TNF-α可減弱si-lncRNA-ATB對KFB周期和相關蛋白表達的影響Fig 4 TNF-α attenuates and reverses the effects of si-lncRNA-ATB on KFB cycle and related protein expression

表4 TNF-α可減弱si-lncRNA-ATB對KFB增殖、相關蛋白表達和膠原合成的抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路在癌中異常激活。NF-κB在結(jié)腸癌細胞系中上調(diào)，下調(diào)NF-κB可減弱過表達lncRNA 癌癥易感性候選物2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)對結(jié)腸癌細胞活力的抑制作用[13]。過表達核因子NF-κB相關lncRNA [nuclear factor (NF)-κB-related lncRNA，lncRNAN KILA]可抑制宮頸癌CaSki細胞中NF-κB的激活，從而抑制CaSki細胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，敲減lncRNA-ATB表達降低了NF-κB信號通路相關蛋白p-p65和p-IκBα的水平；進一步研究結(jié)果顯示，NF-κB活化激活劑TNF-α可減弱敲減lncRNA-ATB表達對KFB增殖和膠原合成的抑制作用，KFB細胞中p-p65和p-IκBα水平增加，KFB細胞活力、cyclinD1水平以及S期細胞百分比升高，G0/G1期細胞百分比降低，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達升高。這表明lncRNA-ATB可通過調(diào)控NF-κB信號通路影響KFB的增殖和膠原合成。

綜上所述，lncRNA-ATB在KFB中表達上調(diào)，敲減lncRNA-ATB表達可能通過下調(diào)NF-κB信號通路抑制KFB的增殖和膠原合成,lncRNA-ATB可能是KD的潛在治療靶點。