邵枝定，高 雪，任 婧，唐曉磊

(皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科，2.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，安徽 蕪湖 241000)

抑郁癥(depression)是一種發(fā)病率較高的神經(jīng)精神疾病，可發(fā)病于各個(gè)年齡段[1]。重度抑郁癥和相關(guān)抑郁癥的病因復(fù)雜，目前還不完全了解[2-3]。抑郁癥的病因有多種假說(shuō)，目前最廣泛的抑郁癥假說(shuō)與細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)，如去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、g-氨基丁酸(GABA)及5-羥色胺(5-HT)等[4-6]。因此提高單胺水平的物質(zhì)可能有益于抑郁癥的治療[7]。在單胺類再攝取抑制劑中，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin re-uptake inhibitors, SSRIs)已被列為一類最有效的物質(zhì)。SSRIs的作用機(jī)制是抑制SERT，使5-HT的突觸水平提高[8]。升高的5-HT濃度會(huì)激活大腦多個(gè)區(qū)域的各種突觸后5-HT受體，可以減輕抑郁癥[9]。此外，細(xì)胞外高濃度的5-HT觸發(fā)了涉及5-HT1A自受體的負(fù)反饋機(jī)制，該機(jī)制調(diào)節(jié)突觸間隙中的5-HT水平。高濃度內(nèi)源性的5-HT可能足以抑制乙酰膽堿受體[10]。

抗抑郁藥物應(yīng)用多會(huì)存在一些不良反應(yīng)[11]。用藥早期個(gè)別患者會(huì)出現(xiàn)頭暈、頭疼、惡心、轉(zhuǎn)氨酶升高等反應(yīng)。因此需要定期監(jiān)測(cè)生化指標(biāo)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并且進(jìn)行改善。鑒于目前治療藥物的不足，以及指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolu-tion of ligands by exponential enrichment, SELEX)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景[12-13]，本研究擬克隆表達(dá)5-羥色胺1A型受體(5-hydroxytryptamine 1A receptor, 5-HT1AR)作為靶標(biāo)，運(yùn)用該技術(shù)篩選能夠特異性結(jié)合5-HTR的適配子制劑，并利用其封閉阻斷5-HT的再攝取，以此發(fā)揮抗抑郁功效。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠(體質(zhì)量：18～20 g)[南京青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(豫)2020-0005]；小鼠骨骼肌肌肉母細(xì)胞系C3H(上?；鶢栴D生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；引物由上海生工公司合成；His標(biāo)簽純化柱子、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(索萊寶公司)；預(yù)染蛋白Marker(賽默飛公司)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thioga-lactoside, IPTG)(Sigma-Aldrich公司)；HRP耦連的小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.15-HT1AR的克隆構(gòu)建：取C57BL/6J小鼠肌肉組織，勻漿后使用Trizol法提取小鼠RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)化為cDNA，應(yīng)用https://www.uniprot.org/uniprot/Q64264根據(jù)NCBI(NM_008308)設(shè)計(jì)引物：正向5′-CGGATCCGATATGTTC AGTCTTGGCCAG-3′(下劃線標(biāo)記為BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)); 反向5′-CAAGCTTGGCGGCAGAA CTTG CACTTG-3′(下劃線標(biāo)記為HindⅢ限制性酶切位點(diǎn));將PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶酶切后與質(zhì)粒pET28a連接，轉(zhuǎn)化入DH5ɑ工程菌，使用卡那霉素抗性LB固體培養(yǎng)基篩選；挑取陽(yáng)性單克隆菌落，擴(kuò)增細(xì)菌提取質(zhì)粒后酶切鑒定。

1.2.2 5-HT1AR蛋白表達(dá)、純化及鑒定：將pET28a/5-HT1AR轉(zhuǎn)化入BL21菌株，配制濃度為0.8 mol/L IPTG，按體積比1∶1 000加入菌液中，于25 ℃經(jīng)4 h誘導(dǎo)表達(dá)；培養(yǎng)結(jié)束后離心收集細(xì)菌，經(jīng)高壓均質(zhì)儀裂解細(xì)菌，4 ℃ 10 000×g離心30 min, 收集上清加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)；通過(guò)Ni-NAT純化重組5-HT1AR蛋白，并利用小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體行Western blot鑒定，同時(shí)行肽指紋圖譜鑒定。

1.2.3 5-HT1AR蛋白適配子的篩選：設(shè)計(jì)合成適配子文庫(kù)[13]：5′-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATA GGGAACAGTCCGAGCC-(N30)-GGGTCAATGCGTC ATA-3′(88 nt，其中N代表A、T、G、C任意一個(gè)堿基)；同時(shí)設(shè)計(jì)引物：P1：5′-GCGGAATTCTAATACG ACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3′；P2：5′-G CGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3′；將純化的5-HT1AR蛋白使用pH 9.6碳酸鹽緩沖液溶解，調(diào)節(jié)至濃度為10、1、0.1和0.01 mg/L，50 μL/孔包被于聚苯乙烯微孔，每3輪使用1個(gè)濃度，共經(jīng)過(guò)12輪正向篩選；于第6輪至第10輪加入5輪反向篩選；并比較每一輪文庫(kù)的相對(duì)結(jié)合力大小。

1.2.4 單克隆適配子的篩選及結(jié)合力的檢測(cè)：將1.2.2中相對(duì)結(jié)合力最高的適配子文庫(kù)經(jīng)PCR擴(kuò)增為雙鏈DNA，并經(jīng)過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到pUC19質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)；挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增ssDNA適配子，并通過(guò)酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗(yàn)法(enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA)檢測(cè)其相對(duì)結(jié)合力。篩選相對(duì)結(jié)合力較高的適配子進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)法驗(yàn)證其識(shí)別位點(diǎn)的一致性：生物素標(biāo)記的適配子與非標(biāo)記的適配子放入5-HT1AR預(yù)包被的微孔中，孵育后洗滌，加入鏈霉親和素標(biāo)記的HRP，孵育后洗滌，通過(guò)顯色底物檢測(cè)450 nm吸光度。

1.2.5 檢測(cè)單克隆適配子的特異性：合成1.2.3中篩選獲得的相對(duì)結(jié)合力最高的單克隆適配子，其5′端使用FAM標(biāo)記，以不同濃度(0、10、20、40和80 mmol/L)適配子分別與小鼠骨骼肌細(xì)胞系C3H避光共孵育45 min，PBS洗滌后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察比較其結(jié)合力。

1.2.6 適配子阻斷5-HT攝取的檢測(cè)： 使用Angilent1260高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)終濃度500 mg/L 5-HT標(biāo)準(zhǔn)品、C3H細(xì)胞培養(yǎng)中起始加入200 mg/L 5-HT、C3H細(xì)胞培養(yǎng)中起始加入200 mg/L 5-HT和適配子10 nmol孵育12 h后培養(yǎng)基內(nèi)5-HT濃度、C3H細(xì)胞培養(yǎng)中起始加入200 ng/mL 5-HT孵育12 h后培養(yǎng)基內(nèi)5-HT濃度；12 h后，細(xì)胞均經(jīng)過(guò)1 000×g離心15 min收集上清。

1.2.7 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)估適配子的治療效果：將小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)分為3組：對(duì)照組：懸掛6 min，觀察后4 min內(nèi)小鼠靜止的時(shí)間；適配子治療組：通過(guò)尾靜脈注射適配子后，懸掛尾部6 min，觀察后4 min內(nèi)小鼠靜止的時(shí)間；試劑對(duì)照組：尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液；藥物治療組：口服20 mg/kg氟西?。煌瑯佑^察4 min內(nèi)小鼠靜止的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pET28a/5-HT1AR表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

瓊脂糖電泳顯示，在1 000 bp和2 000 bp之間有一條條帶，與預(yù)期PCR擴(kuò)增目的條帶產(chǎn)物1 272 bp大小一致(圖1)；pET28a/5-HT1AR質(zhì)粒雙酶切的瓊脂糖電泳分析，產(chǎn)生兩個(gè)條帶，分別為5 kp和1.27 kp，與預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物一致(圖1)；將陽(yáng)性單克隆菌落提取的質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序，其結(jié)果與GenBank(NM_000524)一致。

M.DNA ladder; 1.5-HT1AR; 2.double enzymedigestion of pET28a/5-HT1AR圖1 pET28a/5-HT1AR表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig 1 Identification of expression plasmid pET28a/5-HT1AR

2.2 5-HT1AR表達(dá)及純化

pET28a/5-HT1AR質(zhì)粒表達(dá)的重組5-HT1AR蛋白在40～55 ku有顯著表達(dá)條帶，與預(yù)測(cè)分子質(zhì)量47 ku符合(圖2)。經(jīng)肽指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF) 鑒定分析，其與5-HT1AR肽段序列一致(表1)。

2.3 適配子篩選及鑒定

經(jīng)過(guò)12輪的正向篩選和5輪反向篩選后，將結(jié)合力最高的第12輪適配子文庫(kù)克隆至pUC19質(zhì)粒進(jìn)行篩選(圖3)，共選取51例陽(yáng)性克隆，其中18號(hào)克隆、25號(hào)克隆、31號(hào)克隆和45號(hào)克隆分別表現(xiàn)出較高的結(jié)合力(圖4～6)；同時(shí)對(duì)上述4條ssDNA堿基序列進(jìn)行特異性分析，結(jié)果顯示，其具有高度的同源性(表2)，經(jīng)Mfold軟件分析及ELONA鑒定，4個(gè)適配子可能識(shí)別相同表位(圖7)；流式細(xì)胞檢測(cè)分析18號(hào)適配子與小鼠骨骼肌肌肉母細(xì)胞系C3H顯示出較高的結(jié)合力，且呈一定的劑量依賴性(圖8)；隨后通過(guò)HPLC檢測(cè)5-HT標(biāo)準(zhǔn)品，其保留時(shí)間為4.8 min，將培養(yǎng)體系中加入200 m/L 5-HT，對(duì)加入18號(hào)適配子和不加入適配子12 h后的檢測(cè)，根據(jù)峰面積計(jì)算可知，加入適配子能夠有效地降低系統(tǒng)內(nèi)5-HT濃度(圖9)。

M.protein ladder; 1.purified recombinant human 5-HT1AR protein; 2.uninduced pET28a/5-HT1AR recombinant plasmid; 3.IPTG-induced pET28a/5-HT1AR recombinant plasmid; arrow.recombinant 5-HT1AR protein (molecular weight: 47 ku)圖2 SDS-PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)重組5-HT1AR蛋白Fig 2 Identification of induced expression of recom-binant 5-HT1AR by SDS-PAGE

表1 肽指紋圖譜鑒定重組5-HT1AR蛋白

Horizontal coordinates: 1 to 12 represent round 1 to round 12 libraries, and L represents the initial library; *P<0.05 compared with the 2nd to 12th library圖3 不同文庫(kù)的相對(duì)結(jié)合力的比較Fig 3 Comparison of relative binding force among different pools

表2 4種相對(duì)高結(jié)合力的適配子序列同源性分析

2.4 小鼠懸尾模型驗(yàn)證其抗抑郁功效

80 nmol/L的 18號(hào)適配子注射組其懸尾擺動(dòng)時(shí)間遠(yuǎn)高于未處理模型組、0.9%氯化鈉溶液對(duì)照模型組(P<0.05)(圖10)。

3 討論

早期三環(huán)類和現(xiàn)今的SSRIs類藥物抗抑郁藥物在治療抑郁中發(fā)揮重要作用，臨床觀察發(fā)現(xiàn)它們對(duì)心血管的不良反應(yīng)同樣不容忽視[11,14]?；谶@些抑郁癥治療藥物的諸多不足，本研究擬根據(jù)SSRIs的藥理機(jī)制設(shè)計(jì)一種能夠特異性結(jié)合5-HT1AR的配基，其通過(guò)特異性的空間構(gòu)象與5-HT1AR結(jié)合后阻斷對(duì)5-HT1的攝取，從而保持5-HT的濃度，達(dá)到抗抑郁的功效。5-HT相關(guān)受體種類較多，其中5-HT1AR與抑郁癥的相關(guān)性研究較多，且機(jī)制較為清晰[15]。

Arrow: aptamer double-stranded DNA amplified by PCR from 18 randomly selected monoclonal colonies (88 nt)圖4 PCR鑒定陽(yáng)性克隆Fig 4 Identification of positive clones by PCR

Arrow: monoclonal aptamers with high relative binding force (No.18, 25, 31 and 45)圖5 不同單克隆適配子相對(duì)結(jié)合力的比較Fig 5 Comparison of relative binding force among different monoclonal aptamers

圖6 4種單克隆適配子的親和力的測(cè)定Fig 6 Detection of binding force from four monoclonal aptamers

Bio.adding biotin-labeled aptamers；*P<0.05 compared with different groups圖7 4種單克隆適配子結(jié)合位點(diǎn)一致性的驗(yàn)證Fig 7 Verification of binding site consistency among four aptamers

圖8 流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)分析18號(hào)適配子對(duì)C3H細(xì)胞的結(jié)合Fig 8 Analysis of binding force between aptamer 18 and C3H cell line by flow cytometry

A.5-HT standard substance; B.concentration of 5-HT adding into culture system; C.concentration of 5-HT adding into culture system with aptamer 18 blocking after 12 hours; D.concentration of 5-HT adding into culture system without treatment after 12 hours; E.comparison concentration of 5-HT adding into culture system with aptamer 18 treatment before and after 12 hours; *P<0.05 compared with group without treatment； #P<0.05 compared with group before treatment

*P<0.05，**P<0.01 compared with blank control group without treatment；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group without treatment圖10 小鼠懸尾試驗(yàn)中不同處理組的小鼠擺動(dòng)時(shí)間Fig 10 Exercise time of different treatment in tail suspension test

因此本研究通過(guò)克隆表達(dá)5-HT1AR作為靶標(biāo)，利用SELEX技術(shù)篩選獲得與之高親和力的核酸適配子，并利用適配子干預(yù)5-HT的重?cái)z取。目前核酸適配子篩選已廣泛應(yīng)用至制藥、檢測(cè)、抗感染等領(lǐng)域。其由于自身的分子質(zhì)量較小、靶標(biāo)范圍廣、免疫原性低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于修飾等特性而備受關(guān)注[12-13]。本研究成功構(gòu)建表達(dá)了5-HT1AR蛋白， 并通過(guò)SELEX技術(shù)篩選獲得了兩個(gè)具有較高特異性高結(jié)合力的適配子。因此該篩選獲得的適配子可以封閉5-HT1AR，發(fā)揮抗抑郁的作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示，適配子能夠影響體系內(nèi)5-HT的濃度，但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后其濃度顯著下降，考慮可能為其他受體對(duì)5-HT的結(jié)合所致。本研究?jī)H針對(duì)5-HT1AR進(jìn)行篩選并干預(yù)，還不能完全影響5-HT濃度。

本研究動(dòng)物懸尾實(shí)驗(yàn)中，適配子注射組小鼠的活動(dòng)時(shí)間遠(yuǎn)超出對(duì)照組(模型組、0.9%氯化鈉溶液組)，其與藥物治療組數(shù)據(jù)相當(dāng)。這一結(jié)果顯示本次篩選獲得的適配子具有一定的抗抑郁功效。然而，在本次研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，適配子的高劑量注射引起了小鼠的持續(xù)肌肉緊張，推測(cè)可能因?yàn)檫m配子阻斷5-HT的攝取，導(dǎo)致大量5-HT的積累引發(fā)的高頻興奮所致。適配子結(jié)合5-HT1AR不僅作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其對(duì)有相同結(jié)構(gòu)的其他部位的5-HT1AR均具有高結(jié)合力。目前，根據(jù)適配子的一些自組裝的特異性能，設(shè)計(jì)能夠更精準(zhǔn)識(shí)別人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT1AR的核酸適配子，以期獲得精準(zhǔn)的適配子定位。

綜上所述，本研究初步實(shí)現(xiàn)了通過(guò)SELEX技術(shù)獲得5-HT1AR的核酸配基，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一實(shí)驗(yàn)的可行性以及治療效果。其同時(shí)也為小分子阻斷型生物制劑的研究提供新思路。