楊宇帆，趙亞玲，王 曦，聶 敏，伍學焱，茅江峰

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 內分泌科， 北京 100730)

黃體生成素(luteinizing hormone, LH)或人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)，能夠結合促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/choriogonadotropin recep-tor，LHCGR)而產生睪酮。LHCGR蛋白屬于經典的7跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。當配體和受體結合后，受體的構象發(fā)生變化并激活G蛋白。通過腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)信號傳導途徑，促進雄激素合成[1]。

睪酮在促進男性性別分化和生殖成熟方面發(fā)揮重要作用[2]。在早期胚胎發(fā)育過程中，來源于胎盤的HCG與胎兒睪丸間質細胞(Leydig)中的LHCGR蛋白結合，促進間質細胞成熟并產生睪酮[3]。在青春期前后，睪酮可促進并維持男性第二性征，促進精子生成[4]。

LHCGR基因位于染色體2p21上，包含11個外顯子。與其他G蛋白偶聯(lián)受體相似，LHCGR蛋白含有一個大的細胞外結構域，可與配體結合。它含有7個跨膜螺旋進行信號傳導[4]。LHCGR蛋白由699個氨基酸組成，主要在男性的間質細胞膜和女性顆粒細胞和黃體中表達[5]。

LHCGR基因突變可導致各種疾病發(fā)生。男性LHCGR激活突變可導致非LH依賴性性早熟和Leydig細胞瘤。失活突變則導致睪丸間質細胞發(fā)育不良和睪酮合成障礙，表現為小陰莖和/或尿道下裂或不育。在女性，LHCGR失活突變導致月經稀發(fā)、閉經和不孕癥[5]。

本文報道1例高促性腺激素性性腺功能減退癥的患者，因LHCGR基因發(fā)生復合雜合突變導致小陰莖。雖然臨床表現較為單一，但有助于增加對致病基因和臨床表現的認識。

1 材料與方法

1.1 研究對象

北京協(xié)和醫(yī)院內分泌科收治的1例12歲小陰莖男童。根據病史、生殖器特征和實驗室檢查結果，診斷為“高促性腺激素性性腺功能減退癥”。經患者和其父母知情同意，抽取外周血，提取基因組DNA進行二代測序panel分析。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審批(編號JS-2111)。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室化驗和影像學檢查：實驗室檢查和影像學檢查分別由北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科和放射科完成。

1.2.2 基因組DNA提取:按照操作說明書，提取患者及父母外周血白細胞DNA，進行二代測序panel。

1.2.3 測序：按照操作說明書，使用高通量測序系統(tǒng)Illumina Nextseq 500對產物進行測序。

1.2.4 測序結果分析：二代測序的定制化基因panel檢測結果，參考的基因組版本為GRCh37/hg19，并參考千人基因組、ESP6500(NHLBI Exome Sequencing Project)、EXAC(The Exome Aggregation Consortium)和EXAC-EAS(EXAC約4000個東亞人)的數據庫。將致病基因的測序結果與NCBI網站數據庫進行比對分析(GenBank編號LHCGR)，并與人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)進行比對。

1.2.5 突變驗證: 針對檢測出的變異位點設計特異引物，進行Sanger測序，采用 ABI3730xl DNA 測序儀進行雙端測序。針對c.233+1G>A突變，正向引物為5′-GCATTCAGTCATTTGAAGCAAG-3′，反向引物為5′-TCCTCAGCCTGAATCCAGTTC-3′；針對c.547G>A突變，正向引物為5′-GTTTCTAGCCAGC CAGTTGC-3′，反向引物為5′-ATTGATGGTGGTGGT GATGA-3′。

2 結果

2.1 臨床資料

患兒出生時為男性外陰，陰莖長1 cm，陰囊發(fā)育差，雙側隱睪。1歲行雙側隱睪下拉固定術。隨著年齡增加，陰莖略增長，無陰毛增長。目前患兒12歲，陰莖長度3 cm(圖1A)，嗅覺正常。父母非近親婚配，否認類似遺傳病史。父親青春期發(fā)育正常，身高168 cm。母親青春期發(fā)育正常，身高162 cm，G1P1，月經規(guī)律。

2.2 體格檢查

腹型肥胖，身高162 cm，體質量58 kg。陰莖長度3 cm，周徑4 cm，陰毛P1。雙側腹股溝陳舊手術疤痕，雙側睪丸體積1 mL(圖1A)。乳房B1。

2.3 輔助檢查

LH 31 IU/L↑(N 0.5～6.5 IU/L)，FSH 35 IU/L↑(N 0.4～5.3 IU/L)，雌二醇 44 pg/mL(N 35～65 pg/mL)，睪酮0.99 nmol/L↓(8.4～12.9 nmol/L)。ACTH 36 pg/mL(N 5～65 pg/mL)，血總皮質醇(8am) 176 nmol/L (N 133～537 nmol/L)。其他生化檢查和血尿常規(guī)未見異常。

2.4 診治和隨訪

根據臨床表現和生化檢測，診斷“高促性腺激素性性腺功能減退癥”。針對小陰莖，給予口服十一酸睪酮(膠囊)，每日兩次，每次40 mg。用藥12個月后復診，陰莖長度從1 cm 增加到5 cm，陰毛P3。

2.5 突變位點功能預測

測序結果顯示，LHCGR基因存在復合雜合突變。一個突變?yōu)閏.233+1G>A，位于第2外顯子和第2內含子交界處，來源于母親(圖1B)。該突變會引起mRNA剪切異常。文獻數據庫中沒有該位點的報道。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)指南[6]，此剪切突變?yōu)榈皖l突變，符合PVS1+PM2，判定為疑似致病性變異。

Splice Site Score Calculation軟件預測，該突變導致剪切分數為-1.5，遠小于正常值8.1，提示該位點無法正常剪切。由于第2外顯子不能被完整剪接出來，導致第2外顯子的堿基數量過長，翻譯后形成的氨基酸數量增多，形成69個氨基酸(VIKM*VSYCISKDIRNWNNEFFLRENTFERG*FF*ERNCV*DTHIFLSFEISQIDSLERIEANAFDNLL)，比正常的第2外顯子(含有24個氨基酸，VVPPGGKGAGPLFYTLSSHWMRAA)多了45個氨基酸。與此相應，三維結構蛋白質模型也顯示，突變后的蛋白結構和正常受體結構相比，差異甚大(圖2)。

另一個雜合突變?yōu)閏.547G>A，位于第7外顯子，來源于父親(圖1C)。該突變導致第183位的甘氨酸變?yōu)榫彼?p.G183R)。文獻數據庫中沒有該位點的報道。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)指南[6]，此低頻突變，符合PM2+PM3+BP4，判定為“臨床意義未明”。功能預測軟件PolyPhen、Mutation Taster、PANTHER提示突變?yōu)榱夹?、致病性和可能致病。模擬的蛋白質三維結構顯示，突變LHCGR受體蛋白氫鍵增多，可能影響蛋白極性(圖3)。突變的氨基酸位于受體的胞外區(qū)域，可能干擾與配體的結合。

未檢測到其他和先天性低促性腺激素性性腺功能減退癥或性發(fā)育異常相關的基因突變。

3 討論

本例患兒以“小陰莖，低睪酮，高LH”為突出表現，基因檢測證實LHCGR基因存在剪接位點突變(c.233+1G>A)和錯義突變(c.547G>A)。因此， 臨床診斷LHCGR基因失活突變致小陰莖基本明確。

A.micropenis and old surgical scar of groin; B.a heterozygous mutation c.233+1G→A occurred at the splicing site of the LHCGR gene (between exon 2 and intron 2), with the upper, middle and lower base sequences representing the patient, father and mother, respectively; the arrow indicated the base mutation c.233+1G→A, which originated from the patient’s mother; C.the LHCGR gene is subjected to a heterozygous mutation c.547G→A in exon 7, with the upper, middle, lower base sequences representing the patient, father and mother, respectively; the c.547G→A mutation was derived from the patient’ s father

A.prediction model of normal LHCGR receptor protein; B.Due to the c.233+1G>A splicing anomaly, a prediction model of a completely different protein was formed圖2 正常和c.233+1G>A突變的LHCGR蛋白三維預測模型Fig 2 Prediction 3D models of normal and mutant(c.233+1G>A) LHCGR receptor protein

A.three-dimensiona protein prediction model of normal LHCGR receptor; the red arrow indicates normal hydrogen bond; B.a three-dimensional protein prediction model of G183R mutant LHCGR; the red arrow shows an increase in hydrogen bonds, which may lead to abnormal protein function圖3 正常和c.547G→A突變的LHCGR受體蛋白三維結構預測模型Fig 3 Prediction 3D models of normal and mutant(c.547G>A) LHCGR receptor protein

間質細胞發(fā)育不良(Leydig cell hypoplasia,OMIM #238320)是引起男性性分化異常的罕見病因。黃體生成激素/絨毛膜促性腺激素受體(LHCGR)基因的失活突變可導致間質細胞發(fā)育不良。有文獻描述了因1例LHCGR復合雜合突變導致的性分化異常男性患者，基因突變包括剪接位點突變(c.681-1 G>A)和移碼變異體(c.1582_1585del ATAT，p.Ile528)，臨床表現為睪酮合成障礙和女性外陰[7]。而本例患兒僅表現為小陰莖，可能和患者基因突變導致的功能損傷較輕有關。

本例患者LHCGR的1個基因突變?yōu)閏.547G>A(p.G183R)。多個功能預測軟件提示為致病性突變，模擬的三維結構顯示突變型的LHCGR受體蛋白氫鍵增多，可能影響蛋白的極性。有報道1例由于LHCGR基因發(fā)生純合突變c.580T>G(F194V)性分化異常男童，體外功能研究顯示，194位氨基酸的改變導致LHCGR蛋白在細胞膜上的表達減少，HCG刺激后cAMP生成降低[8]。值得注意的是，本例患兒第183位氨基酸和文獻報道的第194位氨基酸位于同一功能域LRR4(配體結合功能域4)，因此也可能影響蛋白功能。在LHCGR基因失活突變中，有70%的突變導致LHCGR蛋白在細胞膜表達下降。這些患者均表現為兩性畸形或小陰莖[9]。

另一個突變是來自母親的c.233+1G>A，位于第2外顯子和第2內含子交界處。多種預測軟件都顯示，突變導致剪切異常而致病。LHCGR基因發(fā)生剪切位點突變并不少見，發(fā)生在內含子區(qū)域的有c.537-3C>A、c.681-1G>A、c.955-1G>A[7,10-11]，發(fā)生在外顯子區(qū)域的有c.557A>C、c.558G>C和c.580A>G[12-13]。這種類型突變的男性常表現為小陰莖，提示突變僅引起蛋白功能輕度降低[11]。這與本例患者的臨床表現相似。

綜上所述，本研究推測上述兩個位點的復合雜合突變(圖4)可能導致LH受體功能障礙，導致不能合成睪酮，引起陰莖短小或兩性畸形的臨床表現[5]。而患者父母均為致病基因攜帶者，故表現正常。

圖4 患者LHCGR基因復合雜合突變示意圖

在另一方面，LHCGR基因也會發(fā)生激活性突變，引起睪丸間質細胞不斷自主合成睪酮，表現為家族性限男性性早熟[14]，但相同的突變不會導致女性周圍性性早熟[5]。

兒童期開始用雄激素治療，能夠促進陰莖增大[15-16]。但過多雄激素暴露可能導致骨齡提前而影響患兒終身高。因此，需要選擇合適的劑量和療程。本患兒應用小劑量十一酸睪酮治療12個月后，陰莖長度明顯增加，提示治療效果良好。預計隨著治療時間延長，患兒可獲得更好的第二性征發(fā)育。但由于LHCGR突變導致睪丸本身不能合成睪酮，因此產生精子的可能性小。

本研究存在一定局限性，未對突變基因進行體外功能驗證。雖然軟件和蛋白模型能夠預測位點突變導致第2外顯子不能正確的剪切，但軟件預測并不能取代體外功能試驗。本實驗也嘗試利用患者外周血mRNA以驗證剪切位點突變導致第2外顯子剪切異常，但反轉錄未能獲得足量mRNA。這可能和LH受體只表達在睪丸間質細胞，而在外周血中表達太低有關。

綜上所述，本研究通過描述1例LHCGR復合雜合突變導致的小陰莖病例，擴展了對LHCGR基因突變導致性發(fā)育異常發(fā)病機制的認識。同時，通過治療反應，證實了睪酮替代對這類疾病的有效性，為該病的臨床治療提供了有益的借鑒。