詹倩，王富江，葛海濤，?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司，江蘇 南京 211198）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種表現(xiàn)為腎功能快速下降和代謝廢物蓄積的常見臨床綜合征，具體表現(xiàn)為血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平升高，水、電解質(zhì)和酸堿失衡，以及全身各系統(tǒng)癥狀，可伴隨少尿或無尿［1］。據(jù)2015年國際腎臟病學(xué)會報(bào)道，每年約有1 330萬人發(fā)生急性腎損傷，并且每年因急性腎損傷而死亡的人數(shù)約有170萬［2］。目前臨床治療急性腎損傷主要采用液體復(fù)蘇、藥物防治和腎臟替代療法等方法，藥物治療包括抑制細(xì)胞死亡類、抗炎類和修復(fù)類藥物等，由于各種原因，這些療法并未取得很好的臨床療效［3］。因此尋找減緩腎損傷、改善腎功能的藥物具有重要意義。

黃蜀葵花總黃酮（total flavonoids ofAbelmoschus manihot，TFA）是從中藥黃蜀葵花中提取的黃酮類組分，含有槲皮素、蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷、楊梅素等多種黃酮成分，研究表明，這些黃酮成分具有抑制免疫反應(yīng)、改善腎纖維化、抗炎、改善腎功能和減輕腎損傷等藥理作用［4-5］。已有研究發(fā)現(xiàn)TFA 可能是通過抑制ROS，繼而下調(diào)NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)，從而抑制ROS/NLRP3 信號通路減輕阿霉素誘導(dǎo)的腎損傷［6］，但目前TFA治療急性腎損傷的作用機(jī)制研究較少，尚不全面。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于數(shù)據(jù)庫挖掘相關(guān)信息，揭示藥物成分核心靶點(diǎn)，在理解疾病的分子基礎(chǔ)上，預(yù)測藥物的藥理學(xué)作用機(jī)制，評估藥物的藥效、作用途徑和分子機(jī)制。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫和動物實(shí)驗(yàn)靶點(diǎn)驗(yàn)證，初步探究TFA 治療阿霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷的分子機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 黃蜀葵花黃酮類成分的收集

在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（https：//www.cnki.net/）中，以“黃蜀葵花總黃酮”為檢索詞，獲取TFA 成分相關(guān)信息，檢索黃蜀葵花總黃酮含有成分種類及信息。利用化源網(wǎng)（https：//www.chemsrc.com/）查詢成分CAS 號，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取成分結(jié)構(gòu)信息，保存為“SMILES”格式。

1.2 黃蜀葵花黃酮類化合物靶點(diǎn)預(yù)測

將獲得的黃酮類化合物“SMILES”格式導(dǎo)入Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（https：//www.expasy.org/resources/swisstargetprediction），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，得到藥物的預(yù)測靶點(diǎn)，將從化源網(wǎng)中得到的化合物英文名稱導(dǎo)入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），得到黃酮類成分的已驗(yàn)證靶點(diǎn)。將以上步驟所得到的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），統(tǒng)一靶點(diǎn)的Uniprot ID，刪除重復(fù)值，整理得到TFA的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中以“acute kidney injury”為關(guān)鍵詞搜索，以相關(guān)系數(shù)大于2 倍中位數(shù)篩選，在Disgenet 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）中以“acute kidney injury”為關(guān)鍵詞搜索，兩者取并集得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 篩選共同靶點(diǎn)

運(yùn)用易漢博生物信息在線作圖工具（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）將化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)映射，獲得化合物和疾病的共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖，即得到TFA治療急性腎損傷可能的作用靶點(diǎn)。

1.5 核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將化合物和疾病的共同靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 平臺（https：//string-db.org/）中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，相關(guān)性≥0.7，即可獲得共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，以大于Degree 值中位數(shù)2 倍篩選核心靶點(diǎn)，得到核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點(diǎn)通路分析和可視化

將上述獲得的核心靶點(diǎn)信息導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）中，對其進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路注釋分析，運(yùn)用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/login/）制作GO 富集分析結(jié)果的柱狀圖、氣泡圖和KEGG 通路注釋分析結(jié)果的氣泡圖，并將相關(guān)信息輸入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動物

SPF 級KM 小鼠，雄性，體質(zhì)量25～30 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房中，12 h光照，恒溫21～23 ℃、恒濕45%～65%，自由飲食、飲水。

1.7.2 藥物、試劑與儀器

黃蜀葵花總黃酮干粉（江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司，批號：20200929）用蒸餾水溶解制成劑量為228 mg/kg的混懸液。

阿霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：A183027）；MAPK 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab170099）；Akt抗體（英國Abcam 公司，批號：ab8805）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0105M）；過碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（上海碧云天生物術(shù)有限公司，貨號：C0142S）。

全自動組織包埋機(jī)（德國徠卡儀器有限公司，型號：HistoCore Arcadia H）；全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國徠卡儀器有限公司，型號：HistoCore AUTOCUT-149AUTO00C1）；全自動生化分析儀（德國SIEMENS公司，型號：Dimension EXL200）；倒置顯微鏡（德國LEICA公司，型號：DM75M）。

1.7.3 阿霉素腎損傷模型建立及動物分組

30 只KM 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組和給藥組，每組10 只。除正常組外，模型組和給藥組以11 mg/kg 劑量尾靜脈注射阿霉素（溶于生理鹽水）構(gòu)建急性腎損傷動物模型。2 周后檢測24 h尿蛋白，24 h尿蛋白顯著高于正常組則視為造模成功。給藥組小鼠按228 mg/kg 的劑量灌胃給予黃蜀葵花總黃酮混懸液，正常組與模型組小鼠按相同體積灌胃蒸餾水。每日給藥1 次，給藥1 個月后取腎臟，用10%福爾馬林溶液固定。

1.7.4 標(biāo)本采集、處理及指標(biāo)檢測

取組織固定液固定后的腎臟，用石蠟包埋，切成4μm 的腎切片，進(jìn)行HE 染色和PAS 染色，觀察病理結(jié)構(gòu)變化，采用二次免疫組化法檢測Akt和MAPK表達(dá)水平，每組選取3 只小鼠病理切片，使用CaseViewer 軟件放大200倍，每只小鼠病理切片中隨機(jī)選取5個相等面積的視野區(qū)域，用Image J軟件計(jì)算平均光密度（MOD）。

1.7.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組獨(dú)立數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test），以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果

經(jīng)檢索及匯總刪重后，共獲得TFA 相關(guān)靶點(diǎn)基因255個；在GeneCards數(shù)據(jù)庫和Disgenet數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)篩選后共檢索到AKI 相關(guān)靶點(diǎn)基因1 830 個。將上述靶點(diǎn)信息輸入易漢博生物信息在線作圖工具，繪制韋恩圖，得到成分-疾病共同靶點(diǎn)基因169個。見圖1。

2.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9 和M10 依次為異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-mono-beta-D-glucoside）、槲皮素（quercetin）、蘆?。╮utin）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside）、楊梅素（myricetin）、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（Hibifolin）、棉皮素-7-O-α-吡喃鼠李糖苷（Rhodiolgin）、4'，5，7，8-四甲氧基黃酮（4'，5，7，8-Tetramethoxyflavone）、槲皮素-3-O-洋槐糖苷（Quercetin 3-O-robinobioside）和槲皮素-7-Oβ-D-葡萄糖苷（Quercetin-7-O-beta-Dglucopyranoside）。圓形節(jié)點(diǎn)顏色越深，顯示圓形節(jié)點(diǎn)之間相互作用越強(qiáng)。見圖2。

2.3 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.0軟件計(jì)算Degree值篩選核心靶點(diǎn)28 個，其靶點(diǎn)基因信息見表1。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，得到核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)涉及到28 個蛋白，236 條相互作用關(guān)系，結(jié)果提示STAT3、AKT1、MAPK1、TP53、PIK3CA、JUN、RELA、SRC、TNF、VEGFA、EGFR 等可能是TFA 防治急性腎損傷的作用靶點(diǎn)。見圖3。

表1 核心靶點(diǎn)基本信息表

2.4 GO富集分析結(jié)果

DAVID 數(shù)據(jù)庫共富集到GO 功能條目327 個，生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）分別有289、26 和52 個。其中，BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、MAPK 級聯(lián)激活、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控和藥物反應(yīng)等；CC主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞外組分和受體復(fù)合物等；MF主要涉及相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和受體結(jié)合等。GO 功能富集分析柱狀圖（BP、CC、MF 各取P值排名前10位）見圖4。

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果及成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

DAVID 數(shù)據(jù)庫共富集到KEGG信號通路99條，根據(jù)P值選取前20位進(jìn)行展示，見圖5。有顯著性的通路包括Toll樣受體信號通路、乙型肝炎、催乳素信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、碎骨細(xì)胞分化、T細(xì)胞受體信號通路和甲狀腺激素信號通路等。采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。其中M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10與圖2中代表含義相同，網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，各成分可能通過調(diào)控MAPK1、AKT1、TP53、CCND1、TNF、STAT1、PIK3CA、IL2和NFKBIA等靶點(diǎn)基因的表達(dá)，干預(yù)相關(guān)通路治療AKI。

2.6 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 HE、PAS染色結(jié)果觀察

各組小鼠的腎臟組織HE 染色、PAS 染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠腎組織皮質(zhì)深部腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞胞漿疏松淡然，腎小管固縮，腎小球基底膜增厚；與模型組相比，給藥組小鼠腎組織腎小球基底膜輕微增厚，較模型組有所改善。見圖7。

2.6.2 Akt、MAPK在小鼠腎組織中的表達(dá)

與正常組相比，模型組的Akt 表達(dá)顯著下降（P＜0.01），MAPK的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組的Akt 表達(dá)顯著上升（P＜0.01），MAPK 的表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。見表2和圖8、圖9。

表2 各組小鼠腎臟組織中Akt和MAPK蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表2 各組小鼠腎臟組織中Akt和MAPK蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與正常組相比，##P ＜0.01；與模型組相比，*P ＜0.05。

組別劑量（mg/kg）正常組模型組給藥組MAPK（平均光密度/mm2）0.075 8±0.008 5 0.129 5±0.025 3##0.110 0±0.023 8*— —228 Akt（平均光密度/mm2）0.181±0.073 0.076±0.015##0.117±0.039*

3 討論

AKI 是一種短時(shí)間內(nèi)腎功能迅速下降的疾病，其發(fā)病機(jī)制多樣，與缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）、肝移植手術(shù)、冠狀動脈搭橋手術(shù)、橫紋肌溶解癥、膿毒癥以及藥物等相關(guān)，其中缺血/再灌注損傷與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、大量活性氧產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的腎損傷密切相關(guān)［7］。AKI 有發(fā)展成慢性腎病和終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)，因此進(jìn)行AKI 相關(guān)研究具有重要意義。目前根據(jù)臨床癥狀多將其歸為“癃閉”“關(guān)格”等范疇［8］，通常認(rèn)為其病因病機(jī)主要與外邪侵襲、藥毒傷腎等有關(guān)。黃蜀葵花歸腎、膀胱經(jīng)，目前已研發(fā)成新藥——黃葵膠囊，用于治療慢性腎炎、糖尿病腎病以及腎病綜合征等。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到169 個TFA 治療急性腎損傷的潛在靶點(diǎn)，通過進(jìn)一步篩選得到28 個核心靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)包括STAT3、AKT1、MAPK1、TP53、PIK3CA、JUN、RELA、SRC、TNF、VEGFA 和EGFR 等。AKT1 是參與機(jī)體產(chǎn)生AKI 分子機(jī)制中一個重要靶點(diǎn)基因，已有研究證明AKT1 的缺失可以加劇腎缺血再灌注損傷時(shí)的腎小管凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加劇腎功能障礙和病理損害［9］，且腎小管線粒體AKT1的表達(dá)可以減輕腎損傷，保護(hù)腎功能［10］。AKT1 包含于Akt，說明Akt 可能是治療AKI 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。除了AKT1，MAPK 也有可能是治療AKI 的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體產(chǎn)生急性腎損傷的分子機(jī)制中涉及p38MAPK、JUK 的表達(dá)［11］，而MAPK 家族成員包括MAPK1、JNK、p38MAPK 和ERK 等［12］，在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中也起重要作用。

TFA 中含有黃酮成分槲皮素，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過顯著抑制由脂多糖（LPS）引起小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW 264.7 cells）炎癥反應(yīng)過程中JNK、p38MAPK 的激活來降低炎癥介質(zhì)水平［13］，說明TFA 可能會通過抑制體內(nèi)JNK、p38MAPK 的激活來達(dá)到抗炎作用，降低腎臟炎癥反應(yīng)。孫軍等［14］在研究槲皮素對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）保護(hù)作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，槲皮素在增強(qiáng)EPCs細(xì)胞繁殖能力的同時(shí)，可升高EPCs 中Akt 以及磷酸化Akt 的蛋白表達(dá)量，以及PI3K 和Akt3 mRNA 表達(dá)，可見槲皮素可能通過PI3K/Akt 信號通路來發(fā)揮EPCs 保護(hù)作用。在內(nèi)皮損傷后，EPCs可由骨髓動員并歸巢于損傷部位參與血管修復(fù)及新生血管形成，從而對體內(nèi)多個器官損傷血管進(jìn)行修復(fù)［15］，由此可見，TFA 可能通過上調(diào)體內(nèi)Akt表達(dá)，干預(yù)PI3K/Akt信號通路來保護(hù)腎臟EPCs，修復(fù)腎臟內(nèi)損傷部位。趙青等［16］發(fā)現(xiàn)黃葵膠囊（黃蜀葵花提取物）可通過下調(diào)腎組織p38MAPK 的蛋白表達(dá)，減少腎組織內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤、活化，改善腎組織的炎癥性損傷。以上研究結(jié)果提示，Akt 與MAPK 可能是TFA治療AKI的作用靶點(diǎn)。

GO 富集分析結(jié)果顯示，可能的生物過程為MAPK級聯(lián)激活、凋亡過程負(fù)調(diào)控和細(xì)胞增殖正調(diào)控等。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，可能的信號通路為Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路及PI3K/Akt信號通路等。多篇文獻(xiàn)報(bào)道PI3K/Akt信號通路、Toll 樣受體信號通路和HIF-1 信號通路與保護(hù)相關(guān)物質(zhì)誘導(dǎo)的急性腎損傷作用有關(guān)［17-19］。這些通路均為常見炎癥反應(yīng)相關(guān)信號通路，Akt和MAPK在這些通路中起重要作用，炎癥反應(yīng)會加劇腎損傷，通過對Akt與MAPK的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，可減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕腎損傷。動物實(shí)驗(yàn)靶點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組Akt 表達(dá)量顯著上調(diào)、MAPK 表達(dá)量顯著下調(diào)，說明TFA 可能通過調(diào)控Akt 和MAPK 蛋白的表達(dá)，減輕阿霉素誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腎損傷。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，收集TFA治療AKI的潛在靶點(diǎn)，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和GO、KEGG 富集分析，結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)TFA 可能通過上調(diào)Akt 表達(dá)、下調(diào)MAPK 表達(dá)，從而減輕阿霉素誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腎損傷。AKI 產(chǎn)生的原因有多種，阿霉素誘導(dǎo)的AKI 是屬于藥物毒性引起的，臨床上藥物引起的AKI 時(shí)有發(fā)生，其相關(guān)治療作用靶點(diǎn)的研究可為臨床上治療AKI 提供理論依據(jù)，未來還需再進(jìn)一步對TFA治療AKI的相關(guān)通路以及多靶點(diǎn)治療進(jìn)行研究。