劉春雷，胡開治，劉燕琴，曹敏，唐祥友，陳艾萌

1.重慶市藥物種植研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶 408435；2.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000

梔子Ellis為茜草科梔子屬常綠灌木，以干燥成熟果實入藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效，主產(chǎn)于江西、浙江、四川、重慶、福建、湖南等地。梔子果實富含梔子苷、西紅花苷等成分，具有保肝利膽、抗炎、保護心腦血管系統(tǒng)等作用，不僅是許多藥品的原料藥，還可從中提取黃色素，作為天然的食品著色劑，具有巨大的藥用及經(jīng)濟價值。隨著市場需求的不斷增加，各地開始無序發(fā)展，引種混亂，導(dǎo)致其親緣關(guān)系十分復(fù)雜。遺傳育種工作的核心是創(chuàng)造、重組遺傳變異，因此育種工作的成效取決于種質(zhì)遺傳變異的水平，關(guān)于梔子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析已有報道，但由于各研究者選用的梔子群體有所差別或種類不全，其種間、種內(nèi)顯示的多態(tài)性并不完全一致，分析結(jié)果存在一定矛盾。同時由于缺乏基因組數(shù)據(jù)，穩(wěn)定、可靠的分子標記較少，極大限制了梔子遺傳育種的研究。

SSR（simple sequence repeats）也稱微衛(wèi)星DNA，是以少數(shù)幾個核苷酸（1～6個）為單位重復(fù)、總長度數(shù)十堿基對的串聯(lián)重復(fù)序列。與其他分子標記相比，SSR具有分布均勻、特異性高、多態(tài)性信息含量豐富等特點，而且呈共顯性遺傳，符合孟德爾遺傳定律，已廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等方面。目前有關(guān)梔子SSR標記的開發(fā)國內(nèi)外報道非常有限，Xu等利用文庫富集法開發(fā)了22對多態(tài)性SSR引物，Deng等利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)25對具有多態(tài)性的SSR引物，還有一些學(xué)者也利用轉(zhuǎn)錄組序列進行了SSR分析，但沒有進行驗證。本研究以課題組完成的梔子基因組序列為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)方法開發(fā)SSR引物，并對不同居群梔子的遺傳多樣性水平及種群結(jié)構(gòu)進行分析評價，以期為梔子資源開發(fā)利用和分子輔助育種提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

C1000 TouchPCR儀（美國伯樂公司），DYCZ-30Z垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Power B3000電源（美國伯樂公司），Thermo Scientific Pico 21離心機（賽默飛世爾科技有限公司），NanoDropOne超微量紫外分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）。

植物基因組DNA快速提取試劑盒（貨號DE221-50T）、2×Taq Master Mix（貨號SL2610）、瓊脂糖（貨號CA1341），北京酷來搏科技有限公司；聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒（貨號P1340-50T），北京索萊寶科技有限公司。供試梔子材料采自重慶、貴州、四川、江西、浙江、福建6個居群，共57份梔子個體樣本，各樣本間隔10 km以上，統(tǒng)一種植于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)重慶市藥物種植研究所梔子種質(zhì)圃內(nèi)，經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為茜草科植物梔子Ellis，詳見表1。選取幼嫩的梔子葉片，采用改良的CTAB法進行梔子基因組DNA的提取，通過超微量紫外分光光度計及1%瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量，并稀釋至50 ng/μL，置-20℃冰箱保存，備用。

表1 57份梔子樣本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子基因組SSR位點鑒定與分析

采用MISA程序（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對項目組測序組裝完成的染色體水平的梔子全基因組序列（GenBank：GCA_013103745.1）搜索SSR位點，標準為：核苷酸重復(fù)（MNRs，P1）、二核苷酸重復(fù)（DNRs，P2）、三核苷酸重復(fù)（TNRs，P3）、四核苷酸重復(fù)（TTRs，P4）、五核苷酸重復(fù)（PNRs，P5）及六核苷酸重復(fù)（HNRs，P6），重復(fù)單元分別大于10、7、6、5、4、4次重復(fù)；距離100 bp以上的視為一個SSR位點。

梔子SSR在基因組不同區(qū)域的分布見表2。從梔子基因組序列中共搜索到232880個SSR位點，梔子基因組全長為534975 817 bp，平均間隔2.3 kb就有1個SSR位點，其SSR位點序列的平均長度為22.69 bp，GC含量平均為11.29%。其中83.02%的SSR位點分布于參考基因組的基因間區(qū)域，其SSR序列的平均長度最長（22.95 bp），16.5%的SSR分布于內(nèi)含子區(qū)域，而位于外顯子區(qū)域的SSR位點僅有1122個，占0.48%，但其GC含量最高（39.81%）。

表2 梔子SSR在基因組不同區(qū)域的分布

2.2 不同類型SSR位點特征

對不同類型SSR位點特征進行分析，結(jié)果見表3。Perfect SSRs（P型）的數(shù)量為200551，占SSR總數(shù)的86.12%，是Compound SSR（復(fù)合型）數(shù)量的6.2倍。在6種P型SSR中，隨著重復(fù)單元長度增加，SSR位點檢出數(shù)逐漸減少，其中MNRs的數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的64.60%，而HNRs僅搜索到1209個，前3位MNRs、DNRs和TNRs總計188994個，占SSR總數(shù)的81.15%，說明這3種類型在梔子SSR中占主導(dǎo)地位。

表3 梔子不同類型SSR位點的特征

對不同類型SSR位點長度的分析結(jié)果顯示，P型SSR位點的長度介于10～111 bp，平均長度為14.3 bp，其中HNRs的平均長度為25.83 bp，顯著大于其余5種P型SSR，MNRs的平均長度最短，僅為12.55 bp。復(fù)合型SSR位點的長度介于20～817 bp，平均長度為74.72 bp。就GC含量 而 言，HNRs的GC含量最 高（32.46%），其次是DNRs，MNRs的平均GC含量最低僅為2.56%；復(fù)合型SSR的平均GC含量為25.34%，高于P型SSR（9.03%）。

2.3 梔子SSR位點基序分析

從梔子基因組SSR位點的基序組成來看，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序類型依次有2、4、10、31、62、195種。對MNRs、DNRs、TNRs 3種類型SSR進一步分析，結(jié)果見表4。MNRs中基序類型以A/T為主，占總SSR的62.94%；在DNRs型中，（AG/CT）n基序最為豐富，占總SSR位點的4.94%，其次是（AT/TA）n；TNRs型所有10種預(yù)期的重復(fù)基序均被檢測到，其中（AAT/ATT）n的數(shù)量最多，有3669個，占總SSR位點的1.58%，其 次 為（AAG/CTT）n。此 外TTRs、PNRs、HNRs中出現(xiàn)頻率最高的基序類型分別為（AAAT/ATTT）n、（AAAAG/CTTTT）n和（AAAAAG/CTTTTT）n。

表4 梔子SSR位點的基序組成

2.4 引物設(shè)計及篩選

編寫Perl程序提取SSR位點上下游各120 bp的側(cè)翼序列，采用Primer3.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，設(shè)計的參數(shù)為：引物長度18～26 bp，退火溫度56～64℃，GC含量40%～60%。為獲得與基因功能相關(guān)的SSR標記，在排除復(fù)合型SSR位點的基礎(chǔ)上，選擇位于外顯子區(qū)域且具有明確注釋信息的80對SSR引物，作為擴增候選引物。

對3份性狀差別較大的梔子樣品進行SSR-PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL（Mix Taq DNA聚合酶10 μL，10 pmol/μL引物（F+R）1.6 μL，50 ng/μL DNA模板0.6 μL，用ddHO補齊）。反應(yīng)程序為：94℃模板預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，53～60℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，退火溫度隨引物而變化。擴增產(chǎn)物置-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎?%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。其中68對引物擴增成功，占總數(shù)的85%。根據(jù)條帶清晰、多態(tài)性好的原則，進一步篩選出9對引物，對供試梔子樣品進行SSR-PCR擴增。57份梔子樣品共檢測到64條擴增條帶，其中多態(tài)性條帶62條，產(chǎn)物長度為110～300 bp，除引物GD60的多態(tài)性比率為71.4%外，其余引物的多態(tài)性比率均為100%。見圖1、表5。

圖1 引物GD58在部分供試梔子樣品的擴增結(jié)果

表5 開發(fā)的梔子SSR引物序列

2.5 遺傳多樣性分析

對PCR擴增結(jié)果，根據(jù)分子量從大到小依次記作A、B、C、D……，1條為純合，2條為雜合，分別記為AA、AB、BB、AC等，以此類推，進行條帶統(tǒng)計。采用POPGENE1.32軟件計算遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)（）、有效等位基因數(shù)（）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（）、Shannon’s信息指數(shù)（）、多態(tài)位點百分率（PPB）、居群總遺傳多樣性（）、居群內(nèi)遺傳多樣性（）、Nei’s基因分化系數(shù)（）、基因流（）。

利用PopGene1.31軟件對6個居群的梔子樣品進行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表6。梔子物種水平的a、e、、、PPB分別為1.968、1.397、0.251、0.397、96.77%，反映出梔子物種水平具有較高的遺傳多樣性。6個梔子居群的為1.548～1.871，平均1.696；為1.283～1.404；為0.170～0.247；為0.261～0.384；PPB為54.84%～87.10%，各項遺傳多樣性指標均以江西居群最高，其次為重慶居群，浙江居群最低。

表6 梔子居群遺傳多樣性

為0.246，為0.210，為0.146，為2.923，表明居群間存在一定的基因流動，其遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)個體間（85.4%），14.6%的遺傳變異來自居群間。

2.6 聚類分析

根據(jù)Nei’s遺傳距離，采用R軟件ape程序包，對供試梔子居群進行UPGMA聚類分析，結(jié)果顯示6個梔子居群被劃分為2大類，其中重慶、貴州、四川居群聚為一類，福建、浙江、江西居群聚為另一類，其分類具有較強的地域性（見圖2A）。進一步對供試梔子個體樣本進行聚類分析，結(jié)果表明，可在遺傳距離為0.44處，將57份梔子樣本劃分為4大類，其中CQ02、CQ04劃分為B1類，JX03、JX05、JX07、JX08、JX09劃分為B2類，SC01、CQ01、CQ12劃分為B3類，剩余47個梔子樣本聚為B4類。B1、B2、B3類中包含的梔子樣本數(shù)較少，但均單獨聚為一類，說明其組內(nèi)個體間具有較近的親緣關(guān)系，而與其他梔子種質(zhì)遺傳距離較遠（見圖2B）。

圖2 梔子居群及57個梔子樣品UPGMA聚類分析

3 討論

利用全基因組序列大規(guī)模開發(fā)SSR標記，在各種基因組已測序的物種中得到廣泛應(yīng)用。由于前期尚缺乏基因組序列，關(guān)于梔子分子標記的研究進展相對滯后。本研究基于課題組測序組裝獲得的梔子全基因組序列，利用MISA軟件共掃描鑒定到232880個SSR位點，平均每2.3 kb存在1個SSR位點，其數(shù)量和密度遠高于從轉(zhuǎn)錄組序列中搜索到的結(jié)果及咖啡。由于外顯子為基因編碼序列，具有較高的保守性，因此SSR位點主要分布于內(nèi)含子、UTR及基因間等區(qū)域，梔子基因組中的SSR位點的分布頻率也具有相同規(guī)律，各區(qū)域SSR位點所占比例為：基因間＞內(nèi)含子＞外顯子。就SSR位點的平均長度而言，梔子SSR的平均長度為22.69 bp，高于水稻、玉米、馬鈴薯等。在GC含量方面，物種不同，其SSR的GC含量差異較大，同為單子葉植物的玉米SSR位點的GC含量（46.71%）遠高于水稻（27.7%），兩者在外顯子區(qū)域的GC含量均最高，為80%左右，梔子SSR位點的平均GC含量僅為11.29%，外顯子區(qū)域最高為39.81%，均遠低于水稻、玉米，與咖啡相似。

梔子基因組中的SSR數(shù)量豐富，但不同核苷酸類型SSR的數(shù)量差異較大。梔子基因組中單核苷酸型SSR的數(shù)量最多，占64.6%，6種完全型SSR隨著重復(fù)單元長度的增加，其檢出數(shù)越少，與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果一致，而咖啡的二～六核苷酸類型的SSR中，以四核苷酸類型最為豐富。梔子與咖啡的SSR位點基序頻率也存在一定差異，如在梔子四核苷酸重復(fù)基序中（AAAT/ATTT）n最為豐富，而咖啡（AAAT/ATTT）n數(shù)量最多；在梔子五核苷酸重復(fù)基序中（AAAAG/CTTTT）n最豐富，而咖啡（AAAAT/ATTTT）n數(shù)量最多；在梔子六核苷酸重復(fù)基序中（AAAAAG/CTTTTT）n最為豐富，咖啡（AAAAAT/ATTTTT）n出現(xiàn)最多，表明物種間SSR位點的基序頻率普遍存在顯著差異。同時梔子不同類型SSR的優(yōu)勢基元均是以A/T基序為主，從而解釋了前述梔子SSR位點GC含量較低的原因。

分子標記的多態(tài)性是評價SSR標記可用價值的重要指標。本研究從外顯子區(qū)域隨機選取了80對具有明確注釋信息的SSR引物，采用3份梔子材料進行引物篩選，其中85%的引物能夠擴增出清晰的條帶，最后僅篩選出9對多態(tài)性較好的引物，低于Deng等的開發(fā)效率，可能由于篩選的材料較少，遺傳差異不足而淘汰了部分具有利用價值的SSR標記。

遺傳多樣性是生物所攜帶遺傳的信息的總和，是評價生物多樣性的重要部分。已有研究采用多種分子標記對不同梔子群體進行評價，均表明梔子種群具有豐富的遺傳多樣性。本研究對6個梔子居群進行分析，結(jié)果表明物種水平為0.251，為0.397，PPB為96.77%，均反映出梔子物種水平的遺傳多樣性較高，但不同居群的遺傳多樣性水平差別較大。姜武等研究顯示浙產(chǎn)梔子居群的遺傳多樣性水平高于西南居群，本研究結(jié)果卻顯示江西居群的遺傳多樣性最高，其次為重慶居群，而浙江居群最低，可能由于樣本量及采樣范圍有所差別。通過群體分析發(fā)現(xiàn)，梔子居群間存在一定的基因流動（=2.923），其遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)個體間，少部分來自于居群間（=0.146），與前人研究結(jié)果一致。居群聚類分析結(jié)果顯示，地理位置靠近的重慶、貴州、四川居群聚為一類，福建、浙江、江西居群聚為另一類，進一步對供試梔子個體樣本聚類分析結(jié)果顯示，部分不同產(chǎn)區(qū)的梔子個體也聚在同一子類中，說明不同產(chǎn)區(qū)梔子的遺傳分化具有較強的地域性，同時存產(chǎn)區(qū)間的相互引種交流，其親緣關(guān)系十分復(fù)雜。

綜上所述，本研究對梔子全基因組序列中的SSR位點進行分析，并設(shè)計開發(fā)了一批SSR引物，進一步對6個梔子居群進行了遺傳多樣性分析，其引物呈現(xiàn)較高的多態(tài)性，豐富了梔子SSR標記庫，可為梔子種質(zhì)資源的鑒定和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。