鄔薇薇 程 高 王純輝

安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院麻醉科，安徽省合肥市 230000

急慢性疼痛對(duì)認(rèn)知功能特別是對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響日益受到重視，并成為疼痛及認(rèn)知領(lǐng)域研究中的重要內(nèi)容。海馬在學(xué)習(xí)記憶中起著關(guān)鍵作用，1957年Scoville和MiMer在切除癲癇患者雙側(cè)海馬時(shí)導(dǎo)致了患者順行性遺忘，患者表現(xiàn)為很難形成新的記憶。此后海馬在學(xué)習(xí)記憶中的作用得到了大量的研究，目前認(rèn)為短期記憶的發(fā)生與長(zhǎng)期記憶的發(fā)生與存儲(chǔ)可能都與海馬有關(guān)。如果學(xué)習(xí)時(shí)海馬的蛋白質(zhì)合成受到抑制，盡管動(dòng)物仍能正常學(xué)習(xí)，但數(shù)天后再測(cè)試卻表現(xiàn)為記憶的缺失。目前多項(xiàng)研究證實(shí)腫瘤壞死因子(TNF-α)在慢性神經(jīng)疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 Hogg等報(bào)道TNF-α可使海馬神經(jīng)元之間的突觸傳遞效率持續(xù)性減弱，從而影響學(xué)習(xí)記憶[1]。但TNF-α影響學(xué)習(xí)記憶的具體機(jī)制不詳。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (Extracellular regulated protein kinase,ERK)和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (cAMP-response element binding protein,CREB)參與的信號(hào)系統(tǒng)在學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)可塑性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化和細(xì)胞對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2-3]。本研究觀察TNF-α對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ERK/CREB蛋白表達(dá)的影響，探討TNF-α在疼痛和學(xué)習(xí)記憶中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取出生24h的SD胎鼠海馬組織，用小剪刀剪碎，加入 5倍體積的37℃、0.125%的胰酶消化后，反復(fù)吹打，中止胰酶，用 2 000細(xì)胞篩過(guò)濾，形成單細(xì)胞懸液。取5ml單細(xì)胞懸液，1 000r/min離心15min后培養(yǎng)液重懸，選擇細(xì)胞密度為1.0×106ml/L,于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為Neurobasal+2%B27，3d換液1次，首次半量換液。

1.2 免疫熒光鑒定 取培養(yǎng)1周的海馬神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，用預(yù)冷的40g/L多聚甲醛常溫固定15min，PBS洗滌(3min×3次)，再用含0.3% Triton-x-100和5%山羊血清的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉通透1h，加入一抗神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ(1∶200)，4℃濕盒孵育過(guò)夜。次日用PBS洗滌(3min×3次)，加入熒光二抗(Alexa-Fluor 488,1∶500)避光孵育1h。PBS洗滌(3min×3次)，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)元細(xì)胞分為兩組培養(yǎng)：正常培養(yǎng)組和TNF-α組。TNF-α組神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入50μg/L TNF-α，正常組加入相同體積的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48h后行免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元形態(tài)；使用RT-PCR和WB檢測(cè)ERK/CREB mRNA和蛋白表達(dá)情況。

1.4 RNA提取和RT-PCR檢測(cè) 按照RT-PCR的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用Trizol 溶解細(xì)胞,收集胞內(nèi)的總 RNA。使用SYBR Green Premix Ex Tap試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，并在ABI7500qPCR儀進(jìn)行檢測(cè)。使用GAPDH作為內(nèi)參，ERK的正向引物為5’-CCAGGAAAGCATTACCTTGACC-3’，反向引物5’-CCAGAGCCTGTTCAACTTCAATC-3’;CREB的正向引5’-TGGCTAACAATGGTACGGATGG-3’,反向引物5’-GTGCTGTGCGGATCTGGTATGT-3’，GAPDH的正向引物5’-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3’,反向引物5’-TGAGbenGTCAATGAAGAAGGGGTCGT-3’，參考GAPDH的表達(dá)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化ERK和CREB的表達(dá)結(jié)果。用DA相對(duì)拷貝數(shù)和相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)表示ERK和CREB基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè) Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中ERK/CREB蛋白表達(dá)情況。兩組神經(jīng)元培養(yǎng)48h后，用PBS洗滌，lysis buffer裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，在4℃，10 000r/min離心20min，收集上清液，并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白水平。10%的SDS-PAGE溶解40mg蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用TBTS配制的5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，一抗兔抗ERK多克隆抗體(1∶2 000)和兔抗CREB多克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜,TBTS液洗滌3次后，二抗(1∶500)室溫孵育1h，使用ECL法顯影。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察和免疫鑒定 培養(yǎng)48h后大鼠海馬神經(jīng)元貼壁，胞體透亮，飽滿(mǎn)，透光性強(qiáng)，部分細(xì)胞發(fā)出突起，長(zhǎng)短不等，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突起長(zhǎng)度逐漸增加，部分形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖1)。取培養(yǎng)5d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物 β-tubulinⅢ(見(jiàn)圖2)。

圖1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h后光鏡圖(×200)

圖2 海馬神經(jīng)元表達(dá)特異性標(biāo)志物β-tubulinⅢ(×200)

2.2 不同實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)情況 神經(jīng)元分為T(mén)NF-α組和正常組，培養(yǎng)48h后行免疫熒光檢測(cè)，顯示TNF-α組神經(jīng)元神經(jīng)突起長(zhǎng)度(57.2±6.4)μm明顯短于正常生長(zhǎng)組(86.6±7.2)μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h后免疫熒光

2.3 各組ERK和CREB mRNA水平 與正常培養(yǎng)組神經(jīng)元相比，TNF-α組神經(jīng)元細(xì)胞中ERK 和CREB mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 正常組和TNF-α組神經(jīng)元ERK mRNA、CREB mRNA表達(dá)水平比較

2.4 各組ERK和CREB 蛋白表達(dá)情況 與正常組相比，TNF-α組ERK和CREB 蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 正常組和TNF-α組ERK、CREB蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

疼痛是一種注意力依賴(lài)性的感覺(jué)刺激，在個(gè)體學(xué)習(xí)或回憶時(shí)疼痛的出現(xiàn)可能對(duì)學(xué)習(xí)與記憶提取時(shí)的注意力起到分散作用；而學(xué)習(xí)記憶不僅需要大腦運(yùn)行信息整合，也需要認(rèn)知時(shí)注意力的參與。目前臨床研究發(fā)現(xiàn)疼痛可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，炎性痛與神經(jīng)病理性疼痛能夠產(chǎn)生明顯的遺忘效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明急慢疼痛時(shí)通常伴隨認(rèn)知功能障礙。疼痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，涉及眾多的分子和信號(hào)通路[4-5]。

目前認(rèn)為感染和阿爾茨海默病等多種炎癥疾病導(dǎo)致的遺忘效應(yīng)在分子水平的作用靶點(diǎn)主要是皮層與海馬的TNF-α[6]，2014年Liu等就研究發(fā)現(xiàn)慢性神經(jīng)病理性疼痛時(shí)，脊髓背角與海馬的TNF-α升高，并且疼痛時(shí)升高的TNF-α對(duì)脊髓和海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用(LTP)相反，外周神經(jīng)損傷后的TNF-α表達(dá)升高并減弱海馬神經(jīng)元的LTP，降低突觸可塑性[7]。ERK 通過(guò)激活胞質(zhì)中底物而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡起調(diào)控作用,或轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。CREB作為ERK的下游靶標(biāo),對(duì)神經(jīng)可塑性和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)有重要作用，盡管ERK/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中具有重要作用[8-9]，但ERK、CREB作為關(guān)鍵信號(hào)分子，其蛋白的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)是否參與TNF-α受體調(diào)控的疼痛遺忘效應(yīng)仍研究較少。當(dāng)學(xué)習(xí)事件發(fā)生時(shí)，海馬與皮層的興奮性突觸末端的樹(shù)突棘會(huì)表現(xiàn)與學(xué)習(xí)事件相關(guān)的突觸可塑性的結(jié)構(gòu)改變，當(dāng)突觸可塑性改變時(shí)，會(huì)發(fā)生CREB所介導(dǎo)的突觸活性依賴(lài)性變化。CREB作為一個(gè)“記憶蛋白”,在新記憶的發(fā)生與鞏固過(guò)程中都具有這種重要作用。CREB有磷酸化和非磷酸化兩種狀態(tài)，靜息狀態(tài)的CREB保持非磷酸化狀態(tài)，活性低。在接受外界學(xué)習(xí)過(guò)程中，外界學(xué)習(xí)信號(hào)刺激使ERK信號(hào)通路激活，磷酸化ERK使CREB磷酸化增加，磷酸化的CREB活性增加后會(huì)使得胞漿內(nèi)大量具有轉(zhuǎn)錄活性的CREB轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi)從而調(diào)節(jié)記憶相關(guān)的基因表達(dá)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，參與海馬神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)，增強(qiáng)記憶的編碼與形成[10]。

本研究中取大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定，結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)的神經(jīng)元形態(tài)良好，表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物。給予TNF-α刺激后，神經(jīng)元突起長(zhǎng)度明顯短于正常組，同時(shí)ERK和CREB mRNA和蛋白表達(dá)較正常組下降。這也與部分研究結(jié)果相吻合，Sun等報(bào)道TNF-α和TNF-α受體結(jié)合可后通過(guò)調(diào)節(jié)海馬的ERK活性與LTP介導(dǎo)劇烈運(yùn)動(dòng)后的認(rèn)知功能障礙[11]。因此筆者推測(cè)TNF-α可以通過(guò)抑制軸突生成和通過(guò)調(diào)控ERK/CREB信號(hào)通路參與這一過(guò)程。

綜上所述，TNF-α可以下調(diào)大鼠海馬神經(jīng)元中ERK/CREB蛋白表達(dá)，并可能通過(guò)這一信號(hào)通路參與疼痛導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶下降。