張琦夢(mèng),顧華蓉,穆洪濤,趙孟斌,陳瑜珠,高向陽(yáng)*
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642;2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,廣東 廣州 510303;3.汕頭魚露廠有限公司,廣東 汕頭 515021)
魚露又被稱為魚醬油,以低值魚和一定比例的海鹽作為原料,經(jīng)過(guò)數(shù)月甚至數(shù)年的自然發(fā)酵制成,是廣東、福建等地常見的調(diào)味品。作為一種流行的調(diào)味品,傳統(tǒng)魚露具有突出的鮮味和咸味,并伴有一定的甜味和苦味。魚肉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶等作用下分解并發(fā)生美拉德反應(yīng),脂肪氧化、斯特勒克降解等代謝反應(yīng),產(chǎn)生醛、酮、醇、酯等化合物,從而形成魚露獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵過(guò)程通常需要很長(zhǎng)時(shí)間才能確保魚露的溶解以及風(fēng)味和顏色的發(fā)展,因此在不同的發(fā)酵時(shí)間下具有不同的味道特征。
整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,醛類物質(zhì)通常被認(rèn)為是魚露的主要揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì),如3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛和2-辛烯醛等[1],通常帶有肉香味和燒焦味[2]。而其他物質(zhì)隨著發(fā)酵進(jìn)程逐漸轉(zhuǎn)化,表達(dá)出不同的變化趨勢(shì),對(duì)魚露揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行修飾。研究表明,魚露在前期(1~3個(gè)月)變化較為緩慢,醇類、酸類和醛類物質(zhì)迅速積累;而到中期(3~9個(gè)月),醇類(除1-辛烯-3-醇以外的醇類,尤其是乙醇)含量達(dá)到頂峰后,開始消耗,酯類物質(zhì)含量顯著增加,醛類和酸類含量仍然逐漸增加,開始形成較強(qiáng)的香氣物質(zhì);隨著發(fā)酵時(shí)間的變化,尤其是12個(gè)月,魚露的代謝物明顯與其他發(fā)酵時(shí)期不同[3-5]。然而,目前對(duì)魚露的揮發(fā)性物質(zhì)的變化研究多集中在0~12個(gè)月,對(duì)于12個(gè)月后的變化則不明。魚露的揮發(fā)性風(fēng)味是非常復(fù)雜的體系,對(duì)其完整的還原即不破壞其風(fēng)味并將其完整提取出來(lái)是對(duì)風(fēng)味物質(zhì)研究的重要前提。
頂空固相微萃取(headspace solid-phase micro-extraction,HS-SPME)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)樣品前處理過(guò)程技術(shù)的不足,提高了分析檢測(cè)的整體效率,且較能真實(shí)的反應(yīng)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)組成。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gaschromatographmass spectrometer,GC-MS)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)的分離和鑒定。HS-SPME-GC-MS技術(shù)聯(lián)用目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)與分析,如發(fā)酵魷魚[6]、發(fā)酵蝦醬[7]、發(fā)酵乳[8]和酸湯[9]等產(chǎn)品。
本研究以鳀魚為原料,采用傳統(tǒng)發(fā)酵加工技術(shù)進(jìn)行魚露制作,并利用HS-SPME-GC-MS方法分析從原料到發(fā)酵成熟過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量變化,為魚露特殊風(fēng)味的形成機(jī)理及發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)量動(dòng)態(tài)控制及提高魚露的風(fēng)味口感提供理論依據(jù)。
魚露發(fā)酵液(未發(fā)酵,發(fā)酵3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月):廣東省汕頭魚露廠有限公司。
7890A-5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS):美國(guó)Agilent公司;75 μm CAR/PDMS固相微萃取針:美國(guó)Supelco公司。
1.3.1 樣品處理
向25 mL的頂空瓶中加入5 mL魚露樣品和1.5 g NaCl,室溫條件下攪拌20 min,45 ℃條件下平衡30 min;將已活化好的SPME纖維頭(270 ℃老化30 min)在45 ℃條件下頂空萃取揮發(fā)性化合物30 min;于260 ℃條件下解吸5 min,完成進(jìn)樣。
1.3.2 揮發(fā)性成分的GC-MS分析
GC條件:色譜柱為HP-INNOWax TM聚乙二醇毛細(xì)管柱(60 mm×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度為260 ℃,柱初始溫度為35 ℃,保持5 min,以6 ℃/min的速率上升至225 ℃并持續(xù)10 min;載氣為氦氣(He),柱流速為1 mL/min;分流比為10∶1。
MS條件:電子電離(electron ionization,EI)源,離子源溫度為230 ℃,電子能量70 eV,MS四級(jí)桿溫度為150 ℃;掃描范圍:50~550 m/z。
定性定量分析:GC-MS數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫(kù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)0.8L的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照分析,確認(rèn)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱?;衔锵鄬?duì)含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行分析確定。
1.3.3 關(guān)鍵風(fēng)味化合物分析
參照劉登勇等[10]的方法計(jì)算樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用相對(duì)氣味活度值(relativeodoractivityvalue,ROAV)。
選擇對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分定義為ROAVstan=100,其他揮發(fā)性物質(zhì)ROAV則按下式計(jì)算:
式中:C%A、TA分別表示各揮發(fā)性組分的相對(duì)百分含量/%和對(duì)應(yīng)的感覺(jué)閾值/(mg/kg);C%stan、Tstan分別表示對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)百分含量/%和感覺(jué)閾值/(mg/kg)。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理
用IBM SPSS 25.0、Excel 2019軟件和Origin 2019b 64Bit進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。
采用HS-SPME-GC-MS對(duì)不同發(fā)酵階段魚露樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定。不同發(fā)酵階段魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流色譜圖見圖1。由圖1可知,魚露在不同發(fā)酵階段共檢測(cè)出178種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類11種、醇類48種、醛類32種、酮類27種、酯類16種、烴類14種、苯環(huán)類10種、雜環(huán)類10種以及其他類10種。在各個(gè)發(fā)酵階段,分別檢測(cè)出65、69、75、90、90、92種揮發(fā)性物質(zhì)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),魚露中的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量逐漸增加,尤其是酸類、酮類、烴類、苯環(huán)類。與其他研究相比[3,11-13],本研究發(fā)酵時(shí)間更長(zhǎng),所檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量也更多。
圖1 不同發(fā)酵時(shí)間魚露揮發(fā)性成分物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in fish sauce at different fermentation time analysis by GC-MS
不同發(fā)酵時(shí)間魚露的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見表1。由表1可知,酸類(2.99%~30.02%)、醇類(13.97%~41.77%)和醛類(8.67%~51.61%)總含量明顯高于其他類揮發(fā)性化合物,這與陳麗麗等[13-14]的檢測(cè)結(jié)果一致。
表1 不同發(fā)酵時(shí)期魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Table 1 Analysis of volatile flavor compounds in fish sauce at different fermentation periods
續(xù)表
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酸類物質(zhì)主要來(lái)源于氨基酸的分解代謝或脂肪酸的氧化,對(duì)魚露提供奶酪香味。魚露中含有多種短鏈揮發(fā)性有機(jī)酸,如乙酸、丙酸、丁酸及4-甲基戊酸,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均被檢測(cè)到,其主要來(lái)源于直鏈脂肪酸。其中,由葡萄球菌和乳酸菌通過(guò)脂肪酸氧化和丙氨酸代謝產(chǎn)生的乙酸隨著發(fā)酵時(shí)間增加,由原來(lái)的1.88%增加到12.99%,這與SAKPETCH P等[15]的研究結(jié)果一致。丙酸和4-甲基戊酸隨著發(fā)酵時(shí)間先增加后減少。另外異戊酸和戊酸在發(fā)酵前期存在,而壬酸只在后期出現(xiàn)。然而,由于酸的閾值較高,酸對(duì)發(fā)酵魚的揮發(fā)性風(fēng)味作用較小。
醇類通過(guò)氨基酸降解或脂質(zhì)氧化生成,通常被認(rèn)為是發(fā)酵產(chǎn)品中許多生化反應(yīng)的前體[16]。發(fā)酵水產(chǎn)品中的大部分醇是多不飽和脂肪酸氧化的降解產(chǎn)物,具有蘑菇香味和類金屬風(fēng)味,能夠影響發(fā)酵水產(chǎn)品風(fēng)味的形成。正丁醇、正戊醇、1-戊烯-3-醇、正己醇、(Z)-2-戊烯-1-醇及1-辛烯-3-醇在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均被檢測(cè)到。其中,丁醇、戊醇隨著發(fā)酵時(shí)間呈減少趨勢(shì),1-戊烯-3-醇、己醇、(Z)-2-戊烯-1-醇隨著發(fā)酵時(shí)間先增加后減少,1-辛烯-3-醇隨著發(fā)酵時(shí)間先減少后增加。1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化而成的,具有蘑菇香味,ZHOU Y Q等[17]的研究也檢測(cè)到1-辛烯-3-醇,并認(rèn)為其是魚露中一種重要的氣味化合物。異戊醇、1,3-戊二醇在發(fā)酵前期存在,糠醇只在發(fā)酵后期出現(xiàn)。異戊醇是由碳水化合物經(jīng)糖酵解途徑(Embden-meyerhof pathway,EMP)途徑和氨基酸經(jīng)Ehrlich途徑產(chǎn)生的支鏈醇,脫羧酶和乙醇脫氫酶參與Ehrlich途徑[18]。
醛類化合物閾值低,是食品中重要的香氣化合物。通過(guò)賦予青草、堅(jiān)果、糖果和奶酪的氣味,醛類化合物通常在不同的發(fā)酵產(chǎn)品中被消費(fèi)者廣泛接受[19]。本研究檢測(cè)到的醛類主要由脂肪醛組成,其中戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和(E)-2-辛烯醛等來(lái)源于不飽和脂肪酸的自氧化和酶氧化,而支鏈醛是由氨基酸通過(guò)Strecker降解和微生物代謝活性生成的[20]。己醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛及苯甲醛在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均被檢測(cè)到。其中,己醛、壬醛和苯甲醛隨著發(fā)酵時(shí)間先減少后增加,(E)-2-己烯醛及(E)-2-辛烯醛隨著發(fā)酵時(shí)間呈增加趨勢(shì)。3-甲硫基丁醛只在發(fā)酵前期存在,2-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛在中后期出現(xiàn)。其中,2-甲基丁醛提供堅(jiān)果香味,是魚露的特征氣味之一[21],來(lái)源于異亮氨酸的Strecker降解。3-甲硫基丙醛的產(chǎn)生是一個(gè)由氨基轉(zhuǎn)移酶和α-酮酸脫羧酶活性介導(dǎo)的過(guò)程,具有較低的閾值,賦予成品肉味和熟土豆的香味[18],GIRI A等[21]在發(fā)酵魚醬、魚露、醬油和醬油制品也檢測(cè)到3-甲硫基丙醛,并對(duì)魚露的氣味影響最大。
酮類化合物由多不飽和脂肪酸氧化或降解,氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生。據(jù)GAO P等[22]報(bào)道,酮類物質(zhì)導(dǎo)致魚露氣味中有奶酪味。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,2-丁酮、2,3-戊二酮及3,5-辛二烯-2-酮等均被檢測(cè)到。其中,2-丁酮和2,3-戊二酮含量呈穩(wěn)定趨勢(shì);3,5-辛二烯-2-酮含量不斷增加(0.03%~0.96%),具有動(dòng)物油脂味和哈喇味,對(duì)腥味有一定加和作用[23]。烷基二酮可令食品具有強(qiáng)烈的奶香,2,3-戊二酮及2-丁酮均呈現(xiàn)奶香味,黃油的香味可增強(qiáng)腥味物質(zhì)的腥味[24]。
酯類是通過(guò)有機(jī)酸和醇的酯化反應(yīng)形成的。由短鏈酸合成的酯類通常有助于產(chǎn)生水果香氣,而由長(zhǎng)鏈酸合成的酯類則提供脂肪味[25]。本研究檢出了10種芳香族類化合物,有研究表明這些物質(zhì)可能是因環(huán)境被污染而在魚肉中富集導(dǎo)致,會(huì)使魚露呈不愉快的風(fēng)味[26]。在樣品中檢測(cè)到的雜環(huán)化合物包括吡啶、呋喃及其衍生物。這些化合物通常由美拉德反應(yīng)或氨基酸分解形成。據(jù)報(bào)道,在雜環(huán)化合物中,呋喃類化合物會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生氣味影響,使其具有焦糖、甜味和烘焙風(fēng)味[27]。吲哚是一類具有復(fù)雜氣味特征的含氮化合物,被認(rèn)為是微生物酶分解色氨酸的產(chǎn)物[28]。它們?cè)诘蜐舛葧r(shí)伴隨著令人愉悅的氣味,而在高濃度時(shí)會(huì)變成強(qiáng)烈而持久的糞便氣味[29]。
烷烴和烯烴是由脂肪酸的自氧化生成的。烷烴類化合物(0.46%~0.97%)通常認(rèn)為不具有氣味活性,故對(duì)魚露整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。烯烴類化合物(0.32%~5.04%),具有較低的閾值,并且大多帶有果香味,因此能賦予魚露清新和香甜味[25]。在樣品中還檢測(cè)到檸檬烯,通常來(lái)自香料,由于其存在于飼料中,可能在魚中積累[30]。
將各類別揮發(fā)性物質(zhì)含與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,其相關(guān)性如圖2所示,酸類、酮類、烴類、酯類、苯環(huán)類、雜環(huán)類的相關(guān)系數(shù)>0,說(shuō)明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),這些物質(zhì)總含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),15月時(shí)百分含量分別達(dá)到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%;醇類、醛類、其他類化合物的相關(guān)系數(shù)<0,說(shuō)明這些物質(zhì)總含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),15月時(shí)百分比分別達(dá)到了13.97%、27.84%、1.84%。
圖2 魚露中各類揮發(fā)性物質(zhì)與發(fā)酵時(shí)間相關(guān)系數(shù)圖Fig.2 Correlation coefficient between various volatile substances and fermentation time of fish sauce
對(duì)檢測(cè)結(jié)果中的風(fēng)味成分在水中的香味閾值進(jìn)行查詢并計(jì)算,按照食品風(fēng)味研究的一般方法[31],當(dāng)物質(zhì)的ROAV≥1時(shí),則該物質(zhì)對(duì)于揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)大,為主要香氣成分,ROAV越大,對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)就越大;當(dāng)0.1≤ROAV<1時(shí),該成分起到風(fēng)味修飾作用[32]。ROAV越大說(shuō)明這種物質(zhì)對(duì)樣品的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)也越大。結(jié)合表1數(shù)據(jù),可判斷魚露發(fā)酵0月時(shí),正辛醛對(duì)其總體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大,故規(guī)定其ROAV=100,同理,魚露發(fā)酵3月時(shí)2-乙基呋喃總體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大,魚露發(fā)酵6、9、12、15月時(shí)3-甲硫基丙醛總體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大,其他風(fēng)味成分的ROAV由式(1)計(jì)算得出,結(jié)果見表2。
表2 不同發(fā)酵時(shí)間的魚露主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)風(fēng)味活度值Table 2 ROAVs of the main volatile compounds in fish sauce at different fermentation time
如表2所示,發(fā)酵0月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醛類、醇類、含氮化合物和含硫化合物;發(fā)酵3月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為酸類、醇類、醛類、酮類、苯環(huán)類、雜環(huán)類、含氮化合物和含硫化合物;發(fā)酵6月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類、雜環(huán)類和含硫化合物;發(fā)酵9月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和酯類化合物;發(fā)酵12月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和雜環(huán)類化合物;發(fā)酵15月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和雜環(huán)類化合物。異戊醇是整個(gè)魚露發(fā)酵過(guò)程中的主體風(fēng)味物質(zhì);丁酸、異戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫是魚露發(fā)酵前期的主體風(fēng)味物質(zhì);丁酸乙酯是魚露發(fā)酵中期的主體風(fēng)味物質(zhì);癸醛、(E)-2-壬烯醛、3-乙基苯酚是魚露發(fā)酵后期的主體風(fēng)味物質(zhì);3-甲硫基丙醛是魚露發(fā)酵中后期的主體風(fēng)味物質(zhì)且風(fēng)味貢獻(xiàn)率最大,這與李春生等[3]的研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步明晰魚露揮發(fā)性風(fēng)味化合物在發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。
本研究選取在發(fā)酵過(guò)程中各階段的主體風(fēng)味物質(zhì),對(duì)其含量的變化進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖3。
圖3 魚露發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性化合物含量變化的聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat map of volatile compounds contents during fish sauce fermentation
由圖3可知,丁酸、(Z)-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚九種物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間逐漸增加,說(shuō)明這9種化合物很大程度上影響了魚露發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味。發(fā)酵3月和6月的魚露氣味相似,發(fā)酵9月、12月和15月的魚露氣味相似,說(shuō)明在發(fā)酵3月、9月時(shí),揮發(fā)性風(fēng)味發(fā)生顯著變化。
采用HS-SPME-GC-MS技術(shù),檢測(cè)了魚露發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)比分析其發(fā)酵過(guò)程中變化較明顯的化合物,共檢測(cè)出化合物178種,分別為酸類11種、醇類48種、醛類32種、酮類27種、酯類16種、烴類14種、苯環(huán)類10種、雜環(huán)類10種以及其他類10種。酸類(2.99%~30.02%)、醇類(13.97%~41.77%)和醛類(8.67%~51.61%)總量明顯高于其他類揮發(fā)性化合物。酸類、酮類、烴類、酯類、苯環(huán)類、雜環(huán)類的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),15月時(shí)相對(duì)含量分別達(dá)到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%;醇類、醛類、其他類化合物的含量則整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),15月時(shí)相對(duì)含量分別達(dá)到了13.97%、27.84%、1.84%。然后采用ROAV法和聚類分析發(fā)酵過(guò)程中各樣品的主體風(fēng)味構(gòu)成。結(jié)果表明魚露發(fā)酵前期的主體風(fēng)味物質(zhì)有丁酸、異戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫;發(fā)酵中期的主體風(fēng)味物質(zhì)是丁酸乙酯;發(fā)酵后期的主體風(fēng)味物質(zhì)有癸醛、(E)-2-壬烯醛、3-乙基苯酚;3-甲硫基丙醛是魚露發(fā)酵中后期風(fēng)味貢獻(xiàn)率最大的物質(zhì)。魚露的主要關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)由丁酸、(Z)-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚組成。通過(guò)研究鳀魚發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)種類和相對(duì)含量變化,為魚露特殊風(fēng)味的形成機(jī)理及發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)量動(dòng)態(tài)控制提供參考依據(jù),進(jìn)一步指導(dǎo)鳀魚發(fā)酵的風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)化。