郭倩，李雅琪，萬(wàn)生芳，魏昭暉，王同亮，李榮科，張磊，舒暢，李亞玲，楊雅麗

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京211298

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿?。╠iabetes mellitus）常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，可見(jiàn)于60%以上糖尿病患者。DGP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與自主神經(jīng)病變、胃腸激素紊亂、胃組織細(xì)胞病變、高血糖、氧化應(yīng)激等因素密切相關(guān)。DGP屬中醫(yī)學(xué)“痞滿”“嘔吐”“反胃”等范疇，主要由脾氣虛弱，脾失轉(zhuǎn)運(yùn)，營(yíng)氣化生無(wú)源所致，治療以補(bǔ)益脾氣為主。紅芪是甘肅道地藥材，具有補(bǔ)氣健脾、生津養(yǎng)血等功效，紅芪多糖是其主要活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖能夠降低DGP大鼠血糖，促進(jìn)胃動(dòng)力、胃排空及胃激素分泌，保護(hù)和修復(fù)胃平滑肌細(xì)胞及胃黏膜損傷，上調(diào)小腸組織c-Kit、Cx43基因和蛋白表達(dá)?；谇捌谘芯?，本實(shí)驗(yàn)觀察DGP大鼠小腸組織肌電活動(dòng)，結(jié)合氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，進(jìn)一步探討紅芪多糖促進(jìn)腸動(dòng)力、抑制氧化損傷的機(jī)制，為指導(dǎo)其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度23 ℃、相對(duì)濕度50%環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（2020-041）。

1.2 藥物

紅芪多糖，寶雞市方晟生物開(kāi)發(fā)公司，純度72.4%，批號(hào)20200315，臨用前用純凈水溶解，制成濃度分別為12、6、3 mg/mL溶液。枸櫞酸莫沙必利分散片，批號(hào)190614，成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，5 mg/片，將藥品粉碎，用純凈水溶解，制成濃度為0.35 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20 190504；鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)VETEC 公司，批號(hào)WXBD0304V；活性氧（ROS）試劑盒，江蘇酶標(biāo)生物，批號(hào)MB-6608A；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷酸（8-OHdG）、丙二醛（MDA）試劑盒，上海酶聯(lián)生物，批號(hào)分別為ml059387、ml097316、ml028318、ml 077384；Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）抗體、核因子E2相關(guān)因子（Nrf2）抗體、血紅素加氧酶-1（HO-1）抗體，英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為ab139729、ab92946、ab68477；硫氧還蛋白（Trx）抗體，美國(guó)Affinity公司，批號(hào)DF7621；血糖試紙，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司，批號(hào) 478151；β-actin一抗，美國(guó)Affinity公司，批號(hào)AF-7018-100；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，美國(guó)Affinity公司，批號(hào)S0001；DAB顯色液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PV-6000D；Super ECL Plus超敏發(fā)光液，北京普利萊基因科技有限公司，批號(hào)P10100。ML408 生物電放大器（澳大利亞ADInstruments），PL3508生理信號(hào)采集系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments），Accu-Chek Performa型血糖儀（瑞士羅氏），XYJ80-2電動(dòng)離心機(jī)（常州市金壇恒豐儀器廠），Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），AUW220D 半微量電子天平（日本島津公司），F(xiàn)RESCO 21 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模、分組及給藥

將72 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為空白組12只和造模組60只。禁食不禁水12 h，造模組大鼠按55 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液（0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液配制），空白組大鼠注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，測(cè)定隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。糖尿病大鼠以高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)（單日上午進(jìn)食，雙日下午進(jìn)食），連續(xù)4周，測(cè)定血糖≥16.7 mmol/L，并伴有飲水量增加、腹部脹大、體質(zhì)量明顯減輕等表現(xiàn)，隨機(jī)抽取空白組與造模組各2只大鼠檢測(cè)小腸肌電活動(dòng)，造模組大鼠較空白組小腸自主收縮頻率顯著降低，提示造模成功。根據(jù)實(shí)際成模大鼠數(shù)量并綜合考慮模型大鼠死亡率，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組11只，陽(yáng)性藥組和紅芪多糖高、中、低劑量組各10只，另設(shè)空白組10只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)。按照人與大鼠體表面積換算給藥劑量，陽(yáng)性藥組予枸櫞酸莫沙必利溶液3.5 mg/kg灌胃，紅芪多糖高、中、低劑量組分別予紅芪多糖溶液0.12、0.06、0.03 g/kg灌胃，灌胃體積2 mL/只，空白組和模型組灌胃等體積純凈水，連續(xù)8周。

1.5 小腸肌電活動(dòng)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h、禁水2 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉，有齒鑷刺激大鼠四肢，無(wú)疼痛反射且角膜反射存在時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。大鼠仰臥位固定于恒溫解剖臺(tái)，腹部備皮，常規(guī)消毒。劍突下沿上腹正中線剖開(kāi)，切口2～4 cm，暴露小腸，于距離回盲部約2 cm處回腸上置入銀針電極，測(cè)量電極置于腸壁漿肌層（電極直徑0.3 mm，回盲部交界處接正極，向左旁開(kāi)約0.3 cm處胃體接負(fù)極），參考電極夾于大鼠皮下，電極輸入端與生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接，進(jìn)行信號(hào)采集。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：采樣率1 k/s，量程20 mV，低通20 Hz，高通0.3 Hz，50 Hz陷波為開(kāi)，電源濾波器為開(kāi)。檢測(cè)過(guò)程中腸管上方覆蓋溫生理鹽水紗布以減少體溫流失，并關(guān)注大鼠麻醉狀態(tài)，若出現(xiàn)頭部等活動(dòng)或四肢收縮，則適量追加麻醉，使大鼠處于平穩(wěn)麻醉狀態(tài)，便于觀察。波形平穩(wěn)后，連續(xù)記錄60～80 min，以5 min為一個(gè)時(shí)間段，每個(gè)數(shù)據(jù)樣本截取基線平穩(wěn)的波形，隨機(jī)截取6個(gè)時(shí)間段，計(jì)算大鼠各時(shí)間段小腸組織肌電慢波頻率和振幅，取其平均值，采用Lab Chart8 Reader軟件讀取分析。

1.6 ELISA檢測(cè)

給藥結(jié)束后大鼠禁食24 h、禁水2 h，10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，分離小腸組織，剪取100 mg小腸組織于玻璃勻漿器中，加入1 mL生理鹽水，冰浴條件下勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA檢測(cè)小腸組織ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG和MDA水平。

1.7 Western blot檢測(cè)

剪取約100 mg小腸組織，加入1 mL RIPA裂解液，冰上充分研磨，勻漿4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，充分混勻后，100 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫后再次離心5 min，取上清液上樣，5%濃縮膠與10%分離膠進(jìn)行電泳。冰浴、200 mA轉(zhuǎn)膜60 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗滌3 次，滴加Keap1 一抗（1∶1 000）、Nrf2一抗（1∶1 000）、Trx一抗（1∶1 000）、HO-1一抗（1∶10 000）、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出條帶，TBST清滌3次，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光液顯影，采用凝膠成像分析儀采集圖像，Image J 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅芪多糖對(duì)模型大鼠小腸組織肌電活動(dòng)的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織肌電活動(dòng)

表1 各組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅比較（）

2.2 紅芪多糖對(duì)模型大鼠小腸組織活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷酸、丙二醛水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織ROS、8-OHdG、MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織ROS、8-OHdG、MDA水平明顯降低，SOD、GSH-Px 水平明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠小腸組織ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG、MDA水平比較（，ng/mL）

2.3 紅芪多糖對(duì)模型大鼠小腸組織Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1、核因子E2相關(guān)因子、血紅素加氧酶-1、硫氧還蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達(dá)明顯升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達(dá)明顯降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)圖2、表3。

表3 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達(dá)比較（）

圖2 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白免疫印跡

3 討論

DGP是糖尿病常見(jiàn)慢性并發(fā)癥，我國(guó)糖尿病患病率人數(shù)高居全球首位，其中有5年以上糖尿病病史的患者中，有超過(guò)一半患者存在胃輕癱癥狀，臨床表現(xiàn)多為餐后飽脹、厭食、腹脹、嘔惡等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，消渴日久，損傷脾氣，脾氣虛則升降功能失調(diào)，轉(zhuǎn)運(yùn)失常。其根本病機(jī)為脾氣虛弱，失于健運(yùn)，治當(dāng)補(bǔ)氣健脾。紅芪為補(bǔ)氣之要藥，其重要組分紅芪多糖可以改善胰島素抵抗，阻止或延緩2型糖尿病并發(fā)癥。研究表明，紅芪多糖通過(guò)增加Nrf2表達(dá)影響抗氧化酶類表達(dá)，從而調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善糖尿病心肌病小鼠心肌損傷；通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)，抑制脾虛型糖尿病大鼠胃竇組織胃黏膜細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是機(jī)體氧化和抗氧化失衡引起ROS 異常增多的一種病理表現(xiàn)，是心血管和代謝疾病的主要致病因素，也是影響DGP 的重要因素之一。8-OHdG、MDA、SOD和GSH-Px 是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平的常用指標(biāo)。高血糖可使ROS異常增多，氧自由基增加，機(jī)體抗氧化能力降低，代謝失常。SOD、GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可反映機(jī)體的抗氧化水平，有效清除氧自由基，維持機(jī)體氧化平衡。研究表明，抑制氧化酶表達(dá)能提高ROS和MDA含量，引起氧化應(yīng)激。而氧化應(yīng)激參與DGP的發(fā)生發(fā)展，是DGP發(fā)病的重要機(jī)制。

Keap1/Nrf2信號(hào)通路是抗氧化應(yīng)激的經(jīng)典信號(hào)通路，Keap1是氧化還原反應(yīng)的傳感器，通過(guò)氧化還原反應(yīng)使構(gòu)象發(fā)生變化從而使Nrf2解離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與Maf蛋白結(jié)合成異質(zhì)二聚體后與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活調(diào)控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮抗氧化損傷作用，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Keap1是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，能提高機(jī)體對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激，緩解機(jī)體氧化損傷。Nrf2是該信號(hào)通路中重要的細(xì)胞保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游抗氧化酶如HO-1、Trx等表達(dá)并誘導(dǎo)下游抗氧化酶如SOD、GSH-Px基因轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免受ROS 導(dǎo)致的損傷。HO-1 和Trx 是Keap1/Nrf2 信號(hào)通路激活的重要抗氧化酶，能夠清除過(guò)量ROS，維持細(xì)胞氧化/抗氧化平衡。因此，HO-1和Trx的活性對(duì)減輕機(jī)體氧化應(yīng)激程度，維持氧化平衡狀態(tài)有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達(dá)顯著升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達(dá)顯著降低，ROS、8-OHdG及MDA水平顯著升高，SOD和GSH-Px水平顯著降低，這可能是導(dǎo)致DGP大鼠小腸肌電活動(dòng)慢波頻率與振幅降低、出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的原因之一。經(jīng)藥物干預(yù)后，陽(yáng)性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達(dá)顯著降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達(dá)顯著升高，ROS、8-OHdG及MDA水平顯著降低，SOD和GSH-Px水平顯著升高，小腸肌電活動(dòng)慢波頻率與振幅顯著升高，提示機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力明顯改善。

綜上，紅芪多糖能改善DGP大鼠小腸動(dòng)力，其機(jī)制與上調(diào)氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白Nrf2、HO-1、Trx 表達(dá)，下調(diào)Keap1蛋白表達(dá)，降低ROS、8-OHdG及MDA水平，升高SOD和GSH-Px水平有關(guān)。本結(jié)果為課題組進(jìn)一步探討紅芪多糖治療DGP胃腸動(dòng)力障礙的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中藥治療DGP 提供新思路、新方法。