劉琳琳，竇德強(qiáng)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600

黑參為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥根和根莖經(jīng)多次蒸曬（九蒸九曬）得到的一種人參制品。黑參較生曬參、紅參有更強(qiáng)的生物活性，如抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、降血糖、抗腫瘤等，但對(duì)黑參的相關(guān)報(bào)道較紅參和生曬參少，《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于人參炮制品的記載只有紅參和生曬參。黑參最早產(chǎn)于韓國(guó)，近幾年我國(guó)也進(jìn)行了黑參的開(kāi)發(fā)研究，如本課題組已與遼寧地方企業(yè)實(shí)現(xiàn)了黑參產(chǎn)業(yè)化，并制定了遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)《黑參加工技術(shù)規(guī)程》，為黑參資源的質(zhì)量控制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，以人參屬中藥三七、紅參、人參、西洋參、人參葉為研究對(duì)象，對(duì)其化學(xué)成分、靶點(diǎn)進(jìn)行挖掘，以特異性通路→靶點(diǎn)→化學(xué)成分模式篩選出調(diào)控寒熱藥性的靶點(diǎn)，通過(guò)分子對(duì)接以熱力值的形式進(jìn)一步篩選調(diào)控寒熱藥性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用多元統(tǒng)計(jì)分析歸屬黑參的藥性，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 KEGG通路富集分析及反向找靶

人參為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥根和根莖，性微溫。紅參為五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，性溫。西洋參為五加科植物西洋參L.的干燥根，性涼。人參葉為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥葉，性寒。三七為五加科植物三七（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，性溫。以上人參屬中藥的藥味均為甘、微苦。利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別查找5味藥的主要活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)。利用R3.6.3 軟件對(duì)相同藥性藥材的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。通過(guò)對(duì)比去重的方法剔除寒涼、溫性中藥共同涉及的代謝通路，得到寒涼性中藥和溫性中藥的特異性代謝通路。

1.1.2 藥性歸屬及黑參藥性預(yù)測(cè)

以“特異性通路→靶點(diǎn)”模式，通過(guò)通路反向找各藥靶點(diǎn)，剔除寒熱藥共有靶點(diǎn)后得到寒熱特異性靶點(diǎn)，運(yùn)行化學(xué)成分-寒熱特異性靶點(diǎn)-寒熱特異性通路網(wǎng)絡(luò)分析各靶點(diǎn)度值（degree），統(tǒng)計(jì)相同藥性中同一靶點(diǎn)degree。在此基礎(chǔ)上對(duì)藥性賦值（寒＝-2、涼＝-1、微溫＝0.5、溫＝1），并與degree加權(quán)，歸屬排序各靶點(diǎn)所調(diào)控的藥性。統(tǒng)計(jì)相同藥性中同一化合物degree，并對(duì)其進(jìn)行加權(quán)處理，歸屬其寒熱藥性。根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)黑參化學(xué)成分及含量的報(bào)道，初步預(yù)測(cè)黑參的藥性及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.1.3 藥性調(diào)控關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

藥性與機(jī)體的能量代謝密切相關(guān)，即熱性藥促進(jìn)能量代謝而寒性藥抑制能量代謝。因此，將預(yù)測(cè)得到的寒熱藥性相關(guān)靶點(diǎn)按矢量值大小依次輸入KEGG PATHWAY Database（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html），找出與能量代謝直接相關(guān)的靶點(diǎn)（參與糖代謝、氨基酸代謝通路的靶點(diǎn)），取矢量值較大的前5個(gè)靶點(diǎn)作為分子對(duì)接靶點(diǎn)。借助RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）選擇其最佳靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，下載靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，采用TCMSP下載寒熱相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)mol2格式文件。通過(guò)AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，以對(duì)接評(píng)分（docking score）為依據(jù)評(píng)價(jià)化合物與受體匹配情況，分別找出與寒熱藥性相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其上下游蛋白酶，用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2 黑參藥性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物、儀器與試藥

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，5～6周齡，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度（23±2）℃、濕度60%～70%環(huán)境，晝夜12 h自然光照，自由攝食飲水。

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)廠；Caretium酶標(biāo)儀，深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司；UV-2100紫外分光光度計(jì)，上海UNICO公司。

人參葉（批號(hào)20200910）、紅參（批號(hào)20200910）購(gòu)于吉林省撫松縣，黑參（批號(hào)20200910）購(gòu)于遼寧中書堂黑參有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王冰教授鑒定，分別為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥葉、五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖、五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)多次蒸曬（九蒸九曬）后的干燥根和根莖。分別取人參葉、紅參、黑參藥材粉末，加10 倍量蒸餾水，文火煎煮提取2次，第1次提取2 h，濾布過(guò)濾，濾液趁熱抽濾，得上清液，第2次提取1 h，濾布過(guò)濾，濾液趁熱抽濾，得上清液，合并2次上清液作為水煎液，分別濃縮至0.292 5 g/mL（低劑量）和0.585 0 g/mL（高劑量），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BCA 測(cè)試盒（批號(hào)20201205）、超微量Na-K-ATP 酶測(cè)試盒（批號(hào)20201208）、乙酰膽堿酯酶（AchE）測(cè)試盒（批號(hào)20201208）、環(huán)磷酸腺苷（cGMP）測(cè)試盒（批號(hào)2020122）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cAMP）測(cè)試盒（批號(hào)2020122），南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)酮（CORT）測(cè)試盒（批號(hào)202012）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）測(cè)試盒（批號(hào)202012）、甲狀腺素（T4）測(cè)試盒（批號(hào)202012）、細(xì)胞色素C氧化酶（COX）測(cè)試盒（批號(hào)202012），凡科維青島柏舟生物科技有限公司。氫化可的松注射液（20 mL/支，5 mg/mL），天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.2.2 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、紅參低劑量組、紅參高劑量組、黑參低劑量組、黑參高劑量組、人參葉低劑量組、人參葉高劑量組，每組10只。除空白對(duì)照組外，各組小鼠每日灌胃氫化可的松溶液25 mg/kg，連續(xù)30 d。造模8 d起，各給藥組分別灌胃相應(yīng)藥物水煎液，低劑量組5.85 g/kg，高劑量組11.7 g/kg，灌胃體積均為0.4 mL/20 g?？瞻讓?duì)照組及模型組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)21 d。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 一般狀況

每7 d稱量小鼠體質(zhì)量，每日觀測(cè)小鼠毛發(fā)、行為活動(dòng)等是否有異常狀況。

1.2.3.2 血清代謝指標(biāo)含量測(cè)定

末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，摘除眼球取血，2 500 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 測(cè)定T3、T4、CORT、COX、cGMP、cAMP含量，采用紫外分光光度法測(cè)定AchE活力，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.3.3 肝組織Na-K-ATP酶活力測(cè)定

取各組小鼠肝臟相同部位，稱重后置于勻漿器中，按1∶9比例加入0.01 mol/L生理鹽水，冰浴條件下進(jìn)行組織勻漿，2 500 r/min離心20 min，取上清液，分裝，于-80 ℃冰箱保存。采用紫外分光光度法測(cè)定Na-K-ATP酶活力，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 多指標(biāo)綜合分析歸屬黑參藥性

1.3.1 主成分分析

利用SIMCA-P軟件對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行趨向分析，以空白對(duì)照組、寒性模型組為基準(zhǔn)，各給藥組與基準(zhǔn)組之間的距離為主要因素，各給藥組圖形離散程度為次要因素，對(duì)黑參的藥性進(jìn)行歸屬。

1.3.2 聚類分析

將各組指標(biāo)數(shù)據(jù)與模型組比較：較模型組顯著升高時(shí)，＜0.05賦值為1，＜0.01賦值為2；較模型組顯著降低時(shí)，＜0.05賦值為-1，＜0.01賦值為-2；無(wú)顯著變化賦值為0。采用SPSS25.0軟件對(duì)各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果進(jìn)行聚類分析，從而判斷黑參的藥性。

2 結(jié)果

2.1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)藥性歸屬及黑參藥性預(yù)測(cè)

通過(guò)KEGG通路反向找靶，統(tǒng)計(jì)相同藥性中同一靶點(diǎn)的degree。將藥性賦值（寒＝-2、涼＝-1、微溫＝0.5、溫＝1）與degree加權(quán)，按單體化合物矢量絕對(duì)值大小，歸屬其寒熱藥性。溫性中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)分析見(jiàn)表1，寒涼性中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)分析見(jiàn)表2。

表1 人參屬溫性中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)分析

表2 人參屬寒涼性中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)分析

經(jīng)對(duì)比分析可知，槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、R、La、山槐樹(shù)、灌木遠(yuǎn)志酮A、蘇齊內(nèi)酯等為溫性成分。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罌粟堿、Rh、Rb、Rh、Rg為寒涼性成分。由單體皂苷藥性，結(jié)合前期關(guān)于黑參皂苷成分及含量的研究，預(yù)測(cè)黑參的藥性可能為溫性，其藥性物質(zhì)基礎(chǔ)為Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。

2.2 藥性調(diào)控關(guān)鍵靶點(diǎn)

將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)按矢量值輸入KEGG PATHWAY Database，找出與能量代謝直接相關(guān)的溫?zé)岚悬c(diǎn)及寒涼靶點(diǎn)，前5位靶點(diǎn)見(jiàn)表3。將藥性物質(zhì)基礎(chǔ)分別與寒熱靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接分析，結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍衔锓肿优c溫?zé)岚悬c(diǎn)GSK3B、PFKFB3及寒涼靶點(diǎn)PTGS1和AchE結(jié)合性能較好。選用PTGS1和AchE及其上下游蛋白酶進(jìn)行后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)。

圖1 人參屬中藥化合物與寒熱藥性靶點(diǎn)分子對(duì)接分?jǐn)?shù)熱圖

表3 人參屬中藥寒熱藥性與能量代謝直接相關(guān)的靶點(diǎn)（前5位）

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 一般狀況

空白對(duì)照組小鼠眼睛有神，活動(dòng)迅速，背毛濃密、有光澤。造模第7日，體質(zhì)量降低，出現(xiàn)畏寒蜷縮、閉目無(wú)神、精神狀態(tài)萎靡、少動(dòng)、大便溏稀及反抗力減弱。造模第14日，小鼠上述狀態(tài)加重。與模型組比較，各給藥組體質(zhì)量、反應(yīng)活躍程度均有一定程度改善。

2.3.2 指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

各組小鼠血清AchE、Na-K-ATP酶活力，COX、cGMP、cAMP含量及cAMP/cGMP水平見(jiàn)圖2，各組小鼠血清CORT、T3、T4測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。分析可知，紅參主要通過(guò)調(diào)節(jié)Na-K-ATP酶活力、COX含量對(duì)機(jī)體能量代謝產(chǎn)生作用，并通過(guò)升高下調(diào)的cAMP/cGMP水平緩解陽(yáng)虛證。黑參主要通過(guò)調(diào)節(jié)CORT含量對(duì)內(nèi)分泌激素水平產(chǎn)生一定影響，并通過(guò)調(diào)節(jié)COX含量對(duì)機(jī)體能量代謝產(chǎn)生一定作用。人參葉可上調(diào)AchE活力，降低cAMP含量，使cAMP/cGMP水平較模型組有下調(diào)趨勢(shì)。

表4 各組小鼠內(nèi)分泌激素水平比較（x±s，每組10只）

圖2 各組小鼠AchE、Na+-K+-ATP酶、COX、cAMP、cGMP及cAMP/cGMP比較（x±s，每組10只）

2.4 主成分分析

利用SIMCA-P軟件，對(duì)各組小鼠能量代謝指標(biāo)數(shù)據(jù)的平均值歸一化處理后分別進(jìn)行主成分分析，高劑量組和低劑量組數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯觯趨⒔M與紅參組較為趨近。

圖3 各組小鼠指標(biāo)數(shù)據(jù)主成分分析

2.5 聚類分析

利用SPSS25.0軟件，進(jìn)一步對(duì)各組差異性指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，樹(shù)狀圖見(jiàn)圖4。聚為兩類時(shí)，人參葉高、低劑量組為一類，黑參高、低劑量組，紅參高、低劑量組，以及空白對(duì)照組為一類。

圖4 各組小鼠差異性指標(biāo)數(shù)據(jù)聚類分析

3 討論

化學(xué)成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是藥性表達(dá)的一個(gè)方面。同一類藥性藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)可能有共性，結(jié)構(gòu)類似的化合物或成分可能表現(xiàn)出同類藥性。本研究以藥味、歸經(jīng)、功能、主治相似而藥性（氣）有顯著差別的三七、紅參、人參、西洋參、人參葉為研究對(duì)象，以特異性通路→靶點(diǎn)模式，通過(guò)通路反向找靶，剔除寒熱藥共有靶點(diǎn)后得到寒熱特異性靶點(diǎn)，分析化學(xué)成分-寒熱特異性靶點(diǎn)-寒熱特異性通路網(wǎng)絡(luò)找出各靶點(diǎn)degree，統(tǒng)計(jì)相同藥性中同一靶點(diǎn)、化合物degree，在此基礎(chǔ)上對(duì)藥性賦值并與degree加權(quán)，歸屬排序各靶點(diǎn)、化合物所調(diào)控的藥性。

在預(yù)測(cè)的寒熱相關(guān)靶點(diǎn)中找出與能量代謝直接相關(guān)靶點(diǎn)，取矢量值較大的前5個(gè)靶點(diǎn)作為分子對(duì)接靶點(diǎn)，經(jīng)分子對(duì)接得到溫?zé)岚悬c(diǎn)GSK3B、PFKFB3及寒涼靶點(diǎn)AchE、PTGS1與各化合物對(duì)接熱力值較高，這些可能是揭示寒熱藥性的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)虛模型大鼠AchE活力有降低趨勢(shì)，給予溫性藥后AchE活力有升高趨勢(shì)。酶活力越大，酶含量越高，同時(shí)酶的蛋白表達(dá)越高。PTGS1、PTGS2作為同工酶分別編碼COX1、COX2，是將花生四烯酸合成為前列腺素的關(guān)鍵酶，同時(shí)與炎癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系，表明抗炎解熱功效是寒性藥性的重要體現(xiàn)。戴逸飛研究表明，寒性中藥對(duì)酵母致熱小鼠下丘腦中PTGS2蛋白表達(dá)有一定的下調(diào)作用。

當(dāng)機(jī)體處于腎陽(yáng)虛狀態(tài)時(shí)，全身機(jī)能降低，代謝下降，體溫降低，免疫功能減退。腎陽(yáng)虛癥與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的功能變化相關(guān)。下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺軸、甲狀腺軸和性腺軸）功能障礙或低下是腎陽(yáng)虛證的基礎(chǔ)，任何一軸功能下降，均可引起腎陽(yáng)虛證。氫化可的松作為外源性糖皮質(zhì)激素，可升高糖皮質(zhì)激素水平，從而反饋性地抑制垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，使腎上腺皮質(zhì)分泌激素減少，導(dǎo)致腎上腺及性腺器官萎縮、免疫器官損害等。動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，即體質(zhì)量下降、活動(dòng)減少、拱背、蜷縮、被毛疏松無(wú)光澤、畏寒等陽(yáng)虛癥狀。本研究采用氫化可的松灌胃給藥制備陽(yáng)虛小鼠模型，選取寒涼關(guān)鍵靶點(diǎn)及其上下游蛋白酶作為研究對(duì)象，并分別灌胃給予高、低劑量的紅參、黑參及人參葉水煎液，觀察各組小鼠體征指標(biāo)及體內(nèi)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，人參葉與紅參和黑參相比，作用效果不顯著，可能與其藥性為寒性相關(guān)。

槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、三七皂苷R、La、山槐樹(shù)、灌木遠(yuǎn)志酮A、蘇齊內(nèi)酯等成分藥性為溫性。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罌粟堿、Rh、Rb、Rh、Rg等成分藥性為寒涼性。對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析可知，黑參的藥性為溫性，其藥性物質(zhì)基礎(chǔ)為Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。