陳騰飛，練東銀，高云航，宋玲，李晗，侯紅平，李建良，彭博，葉祖光，張廣平

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100029

金骨蓮為經(jīng)典苗藥，收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》和《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄》，由透骨香、漢桃葉、大血藤、八角楓、金鐵鎖5味藥組成，具祛風(fēng)除濕、消腫止痛功效，常用于風(fēng)濕痹阻所致關(guān)節(jié)腫痛、屈伸不利等。方中大血藤又名紅藤、紅皮藤，具有清熱解毒、活血祛風(fēng)、止痛功效，用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕等疾病，能夠抑制炎性因子，減輕炎癥反應(yīng)。大血藤主要含有紅景天苷、香草酸、原兒茶酸等酚類成分，以及綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸類成分。紅景天苷為其重要的藥理活性成分，藥理學(xué)研究表明，紅景天苷通過調(diào)控與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕大鼠骨關(guān)節(jié)炎急性期的疼痛和關(guān)節(jié)腫脹，減少血清中炎性因子的含量而發(fā)揮抗炎作用；還可通過HIF-1α/EPO途徑降低腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的轉(zhuǎn)錄活性，激活HIF-1α通路，降低細(xì)胞分化和礦化程度，進(jìn)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。課題組前期研究表明，金骨蓮提取物能明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，其抗炎作用與抑制PI3K/Akt途徑有關(guān)。因此，考察血漿中紅景天苷的濃度有利于進(jìn)一步明確金骨蓮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）技術(shù)靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，樣品前處理方法相對(duì)簡(jiǎn)單，尤其適用于血漿、組織等復(fù)雜基質(zhì)中外源性或內(nèi)源性成分的濃度測(cè)定。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道血漿中紅景天苷的檢測(cè)方法及其單體或復(fù)方給藥后大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，但現(xiàn)有方法或靈敏度較低，或分析時(shí)間較長(zhǎng)，或生物樣本用量大，且未見報(bào)道連續(xù)給藥后紅景天苷在體內(nèi)是否有蓄積效應(yīng)。因此，本研究建立HPLC-MS/MS測(cè)定血漿中紅景天苷濃度的方法，用于金骨蓮連續(xù)14 d給藥后大鼠體內(nèi)紅景天苷藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

Qtrap 5500超高靈敏度三重四極桿串聯(lián)線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，包括ExionLC AC液相色譜儀和Qtrap 5500質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（德國(guó)Mettler-Toledo 公司）；RVC 2-18 CDplus 真空濃縮儀（德國(guó)Christ 公司）；Centrifuge 5254R 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；Vortex-genie2 G560E 漩渦儀（美國(guó)SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

紅景天苷（Salidroside，98.6%，批號(hào)110818-202009），中國(guó)食品藥品檢定研究院；水楊苷（Salicin，內(nèi)標(biāo)，98.0%，批號(hào)L810U79），北京百靈威科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純），美國(guó)ROE SCIENTIFIC公司；丙酮（色譜純），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；純凈水，中國(guó)杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。金骨蓮膠囊提取物（批號(hào)20190314），貴州益佰制藥股份有限公司。

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021B196）。于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)至少5 d，溫度（23±1）℃，濕度50%±15%，12 h 晝夜交替。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及質(zhì)控溶液制備

精密稱取紅景天苷適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，搖勻后，用甲醇稀釋成濃度為1.00 mg/mL的紅景天苷貯備液。用甲醇按一定比例將貯備液稀釋成紅景天苷濃度依次為10 000、7 500、5 000、2 000、1 000、200、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，以及紅景天苷濃度為7 500、2 000、200、100 ng/mL的質(zhì)控溶液，-80 ℃冰箱冷凍保存。臨用前，用空白血漿將上述標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)控溶液稀釋10倍，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備

精密稱取水楊苷適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，搖勻后，用甲醇稀釋成水楊苷濃度為1.00 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。用丙酮按一定比例將其稀釋成水楊苷濃度為50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，-80 ℃冰箱冷凍保存。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品50 μL，置1.5 mL離心管中，加入400 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min，超聲處理（頻率40 kHz，下同）1 min，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，取上層溶液350 μL，45 ℃、1 700 r/min減壓濃縮至干燥，各加入100 μL甲醇，渦旋1 min，超聲處理1 min，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，取上清液10 μL 進(jìn)樣分析。

2.4 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜條件：采用飛諾美Kinetex C18 100 ?色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為甲醇（B）-水（A），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～1.5 min，5%～85%B；1.5～2.5 min，85%B；2.5～2.6 min，85%～5%B；2.6～5 min，5%B），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），氣簾氣35 psi，碰撞氣為Medium，噴霧電壓-4 500 V，輔助氣加熱溫度500 ℃，輔助氣1 為45 psi，輔助氣2 為45 psi。紅景天苷和水楊苷（內(nèi)標(biāo)）定量分析離子對(duì)（）分別為299.0→119.1 和285.2→123.1，碰撞能分別為-17.6 V和-24.1 V，去簇電壓分別為-44.2 V和-81.7 V。

2.5 方法學(xué)考察

按2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）“9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括選擇性、線性、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率，以及穩(wěn)定性等。

2.5.1 選擇性考察

取大鼠空白血漿各50 μL，分別加入400 μL丙酮、400 μL內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行蛋白沉淀處理后，再按“2.3”項(xiàng)下方法制備空白血漿樣品和內(nèi)標(biāo)樣品；取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品50 μL、給藥后血漿樣品50 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，制備含標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品和大鼠給藥后6 h血漿樣品。上述4種樣品按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和分析，得紅景天苷和內(nèi)標(biāo)水楊苷在不同樣品中的提取離子流色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，金骨蓮膠囊中的待測(cè)成分紅景天苷的保留時(shí)間為3.91 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為3.94 min，峰型良好?？瞻籽獫{中相應(yīng)的保留時(shí)間無明顯的內(nèi)源性物質(zhì)或雜質(zhì)的干擾，表明該血漿處理方法和分析方法的選擇性良好。

圖1 大鼠血漿中紅景天苷和內(nèi)標(biāo)HPLC-MS/MS圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限考察

取大鼠空白血漿，按“2.1”項(xiàng)下方法配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（紅景天苷濃度依次為1 000、750、500、200、100、20、10 ng/mL），按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和分析，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)（1/）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.001 19＋0.005 38，＝0.999 1，線性范圍為10～1 000 ng/mL，線性關(guān)系良好，定量限為10 ng/mL（信噪比S/N＞10）。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度

取大鼠空白血漿，按“2.1”項(xiàng)下方法制備紅景天苷濃度為10、20、200、750 ng/mL的定量下限、低、中、高4個(gè)濃度質(zhì)控樣品，按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和分析，平行操作6份樣本，測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度，與標(biāo)示濃度對(duì)照，計(jì)算準(zhǔn)確度，并計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果顯示，紅景天苷的批內(nèi)精密度RSD為1.9%～6.4%，準(zhǔn)確度為100.1%～108.0%；批間精密度RSD為3.5%～6.1%，準(zhǔn)確度為102.1%～106.4%，均符合相關(guān)要求，提示該方法的準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取娃哈哈純凈水50 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法加入內(nèi)標(biāo)溶液并濃縮干燥，之后加入100 μL對(duì)應(yīng)濃度的低、高濃度質(zhì)控溶液復(fù)溶，處理后取上清采用“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，測(cè)得紅景天苷的峰面積為A（每個(gè)濃度平行6份）；取大鼠空白血漿50 μL（6個(gè)不同來源），按“2.3”項(xiàng)下方法加入內(nèi)標(biāo)溶液并濃縮干燥，之后加入100 μL對(duì)應(yīng)濃度的低、高濃度質(zhì)控溶液復(fù)溶，處理后取上清采用“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，測(cè)得紅景天苷的峰面積為B；取大鼠空白血漿（6個(gè)不同來源），按“2.1”項(xiàng)下方法制備低、高濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和分析，測(cè)得紅景天苷的峰面積為C。B與A的比值為基質(zhì)效應(yīng)，C與B的比值為提取回收率。結(jié)果顯示，紅景天苷的基質(zhì)效應(yīng)為32.1%～61.9%，存在一定的基質(zhì)抑制作用，RSD 為11.0%～14.1%，說明個(gè)體間的基質(zhì)效應(yīng)差異不大，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后，不影響生物樣品定量分析的準(zhǔn)確性。血漿樣品中紅景天苷的提取回收率為33.3%～51.7%，RSD為11.4%～11.7%。

2.5.5 穩(wěn)定性

選擇低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控溶液，以空白大鼠血漿按“2.1”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)濃度的質(zhì)控樣品，各濃度質(zhì)控樣品分別在室溫放置2 h、-80 ℃→室溫凍融2次、-80 ℃放置30 d后，按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和分析，并將樣品處理后在進(jìn)樣器放置24 h后，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，每個(gè)濃度平行6份樣品。以當(dāng)日新配制的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度及各質(zhì)控樣品的精密度和準(zhǔn)確度，考察樣品放置穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，紅景天苷室溫放置2 h后各濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度為103.1%～104.3%，精密度RSD 為2.0%～5.9%；-80 ℃→室溫凍融2次后各濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度為97.0%～107.1%，精密度RSD 為4.2%～4.9%；-80 ℃放置30 d后各濃度質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度為102.4%～103.1%，精密度RSD為1.4%～2.7%；進(jìn)樣器放置24 h后各濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度為101.7%～107.3%，精密度RSD為2.8%～9.6%，表明上述處理?xiàng)l件及放置條件下樣品穩(wěn)定，可以滿足定量分析的要求。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

雄性SD大鼠5只，適應(yīng)性飼養(yǎng)后，于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。金骨蓮膠囊提取物用0.5%CMC-Na溶解后，按10 mL/kg灌胃給藥（相當(dāng)于60 g原藥材/kg），連續(xù)給藥14 d，分別于第1、14日給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、2、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢采血約0.2 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，12 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移血漿，-80 ℃冰箱冷凍保存。采用已建立的分析方法對(duì)血漿中的紅景天苷進(jìn)行定量分析，并采用MaS Studio 1.5.2.14軟件計(jì)算灌胃給藥金骨蓮膠囊提取物后大鼠體內(nèi)紅景天苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（非房室模型），對(duì)第14日和第1日給藥后的藥代參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

取各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下條件處理，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，以當(dāng)日配制的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅景天苷血藥濃度，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖2。

圖2 大鼠連續(xù)14 d灌胃金骨蓮膠囊提取物的紅景天苷藥-時(shí)曲線（x±s，n＝5）

采用非房室模型計(jì)算紅景天苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。第14 日給藥后、AUC、AUC、MRT、MRT分別為（1 123.57±88.35）ng/mL、（2 861.62±514.98）ng·h/mL、（2 867.93±514.60）ng·h/mL、（1.56±0.21）h、（1.58±0.21）h，與第1日給藥后的各參數(shù)相比較，均無顯著性差異，說明連續(xù)給藥后紅景天苷在大鼠體內(nèi)的暴露量和平均駐留時(shí)間無明顯增加，未發(fā)現(xiàn)蓄積效應(yīng)。另外，與第1日給藥金骨蓮膠囊提取物后比較，第14日給藥后紅景天苷的明顯縮短（＜0.01），明顯提前（＜0.05），說明連續(xù)給藥后大鼠體內(nèi)紅景天苷消除變快。

表1 紅景天苷給藥不同時(shí)點(diǎn)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（x±s，n＝5）

3 討論

本研究建立了大鼠血漿中紅景天苷濃度測(cè)定的HPLC-MS/MS方法，并以此快速、靈敏、準(zhǔn)確分析了灌胃給藥金骨蓮膠囊提取物后大鼠血漿中紅景天苷的濃度，系統(tǒng)考察了連續(xù)14 d給藥金骨蓮后紅景天苷的藥代動(dòng)力學(xué)特征，初步明確了紅景天苷的體內(nèi)暴露程度和體內(nèi)過程，為苗藥金骨蓮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究提供了參考。

首先，對(duì)蛋白沉淀試劑進(jìn)行優(yōu)化。蛋白沉淀試劑的選擇，直接影響到樣品處理的結(jié)果。本試驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯及二氯甲烷作為蛋白沉淀試劑，處理含有同等濃度的紅景天苷血漿樣品，發(fā)現(xiàn)丙酮處理后，樣品中紅景天苷的峰面積最大，靈敏度更高，因此選擇丙酮作為蛋白沉淀試劑。

其次，優(yōu)化了色譜條件。流動(dòng)相及色譜條件也會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，本試驗(yàn)考察了不同品牌的C18色譜柱，以及乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%甲酸水及甲醇-0.05%甲酸水等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，并優(yōu)化了等度和梯度洗脫程序，結(jié)果表明飛諾美Kinetex C18 100 ?色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）在4種流動(dòng)相系統(tǒng)均能獲得較好的色譜峰形，綜合考慮色譜柱的清洗、保護(hù)及保存等因素，最終選擇甲醇-水梯度洗脫的方式作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

采用以上條件建立的HPLC-MS/MS 方法能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確分析大鼠血漿中紅景天苷的濃度，適用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。通過藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，給藥金骨蓮后，紅景天苷在大鼠體內(nèi)迅速被吸收并達(dá)到峰濃度，第14日給藥后的達(dá)峰時(shí)間和半衰期比第1日給藥后均有所減少，分析原因可能是金骨蓮膠囊是復(fù)方制劑，成分種類較多，單次或連續(xù)給藥后會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的藥物-藥物相互作用及不同藥物成分與肝藥酶的相互作用，使紅景天苷的吸收、代謝和排泄發(fā)生改變。大鼠1次/d連續(xù)14 d給藥金骨蓮，末次給藥后大鼠血漿中紅景天苷的峰濃度、體內(nèi)暴露量（曲線下面積）及平均駐留時(shí)間與首次給藥后相比較，均無明顯升高，表明連續(xù)給藥金骨蓮后紅景天苷無蓄積效應(yīng)。