曾薈，邱韻靜，譚梓君，魏梅，曹斯瓊，徐敏，李國(guó)衛(wèi)，何民友

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山528244

墨旱蓮為菊科植物鱧腸L.的干燥地上部分，具有滋肝補(bǔ)血、涼血止血功效，臨床用于牙齒松動(dòng)、須發(fā)早白、眩暈耳鳴、腰膝酸軟，及陰虛血熱之吐血、衄血、尿血、血痢、崩漏下血、外傷出血。全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于江蘇、江西、浙江、廣東、湖北等地。目前已從墨旱蓮中分離并鑒定出的化合物有三萜及其皂苷、甾體、黃酮、香豆素、木脂素、噻吩、生物堿、酚酸以及聚乙炔等。藥理學(xué)研究表明，墨旱蓮具有很強(qiáng)的保肝、抗炎、抗菌、抗自由基、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用。

墨旱蓮為一年生本草，花期7－8月，果期8－11月，花開(kāi)時(shí)采割地上部分，部分地區(qū)可根據(jù)花期適當(dāng)延長(zhǎng)至11月。為保證墨旱蓮藥材的質(zhì)量，應(yīng)在合適的花期進(jìn)行采收，合理控制墨旱蓮藥用部位的花、葉、莖比例。目前，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》墨旱蓮藥材項(xiàng)下僅對(duì)單一化學(xué)成分蟛蜞菊內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定，難以區(qū)分墨旱蓮不同藥用部位。本研究通過(guò)超高相液相色譜法（UPLC）建立墨旱蓮的特征圖譜，并對(duì)墨旱蓮中5種成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)合相似度分析、聚類分析和主成分分析區(qū)分墨旱蓮的不同藥用部位。

1 儀器與試藥

Waters H-Class型超高液相色譜儀，Waters公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；XP26型百萬(wàn)分之一電子天平、ME204E型萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)，默克股份有限公司。

11批墨旱蓮藥材樣品經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為菊科植物鱧腸L.的干燥地上部分，取部分藥材挑選得到11批花、葉、莖部位，分別編號(hào)為H1～H11、Y1～Y11、J1～J11。產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 11批墨旱蓮藥材產(chǎn)地信息

對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、木犀草苷（批號(hào)111720-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）、4,5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)111894-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.1%）、蟛蜞菊內(nèi)酯（批號(hào)111885-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；異綠原酸B 對(duì)照品（批號(hào)wkq19012301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.97%），四川省維克奇生物科技有限公司；乙醇為分析純，乙腈、三乙胺、磷酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選擇Agilent SB C色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，流動(dòng)相A 為乙腈、B 為0.53%磷酸溶液（含0.8%三乙胺），梯度洗脫（0～3 min，11%→16%A；3～9 min，16%A；9～20 min，16%→20%A；20～34 min，20%A；34～40 min，20%→80%A；40～41 min，80%→11%A；41～50 min，11%A），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?；鼘幩帷Ⅲ豺嗑諆?nèi)酯對(duì)照品適量，置20 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，配制成濃度分別為4.401、186.711、95.951、98.617、102.837 μg/mL 的混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.4、1、2 mL，置于10 mL量瓶中，用70%乙醇定容，得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取墨旱蓮藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以蟛蜞菊內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.12%，相對(duì)峰面積RSD 為0.44%～1.75%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以蟛蜞菊內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到供試品溶液各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.10%～0.19%，相對(duì)峰面積RSD為0.34%～5.97%，除峰4外，色譜峰相對(duì)峰面積RSD為0.34%～2.36%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的墨旱蓮樣品6份，每份約1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以蟛蜞菊內(nèi)酯色譜峰為參照峰S，計(jì)算得到各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.19%，相對(duì)峰面積RSD為0.55%～1.92%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.5.1 特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取11 批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。選擇成分已知、峰型和分離度較好、純度較高的峰，確定9個(gè)共有峰。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)5個(gè)色譜峰：1號(hào)峰為咖啡酸峰，2號(hào)峰為木犀草苷峰，3號(hào)峰為異綠原酸B峰，6號(hào)峰為4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱?，9號(hào)峰為蟛蜞菊內(nèi)酯峰，見(jiàn)圖2。以峰型較好、峰面積較大的9號(hào)峰蟛蜞菊內(nèi)酯峰為參照峰（S）。分別對(duì)11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果11批墨旱蓮藥材相似度為0.906～0.988，表明墨旱蓮藥材的整體質(zhì)量比較穩(wěn)定；11批花、葉、莖相似度分別為0.895～0.993、0.880～0.991、0.885～0.995，表明墨旱蓮?fù)凰幱貌课婚g相似度良好。見(jiàn)表2。

表2 11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖相似度評(píng)價(jià)

圖1 11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖UPLC特征圖譜共有峰

圖2 墨旱蓮藥材及其花、葉、莖UPLC圖

2.5.2 聚類分析

以9個(gè)色譜峰峰面積為數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS20.0軟件，采用組間平均數(shù)連接法，以平方Euclidean 為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)墨旱蓮藥材及不同部位樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果可將樣品聚為三類（見(jiàn)圖3），花、葉、莖各一類，藥材在三類中均有分布。聚類分析可將花、莖、葉部位區(qū)分開(kāi)，與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致，表明墨旱蓮不同藥用部位存在明顯差異。

圖3 11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖樣品聚類分析

2.5.3 主成分分析

對(duì)11批藥材及花、葉、莖樣品9個(gè)色譜峰峰面積數(shù)據(jù)處理后，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，主成分1、主成分2的特征值＞1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)77.925%（見(jiàn)表3），基本能體現(xiàn)原樣品的信息。以主成分1、2為變量，得到二維投影圖，在投影圖中選取距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn)，權(quán)重值越大，該化合物在墨旱蓮藥材中的作用越大，見(jiàn)圖4。分析可見(jiàn)，對(duì)主成分1產(chǎn)生較大影響的有峰1（咖啡酸）、峰3（異綠原酸B）、峰4、峰6（4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸），對(duì)主成分2影響較大的是峰7、峰8、峰9（蟛蜞菊內(nèi)酯）。見(jiàn)表4。主成分得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖5，樣品可分別聚成花、葉、莖（除J9）三類，與聚類分析結(jié)果基本一致。從主成分1軸分析，發(fā)現(xiàn)在此維度上葉與莖存在交叉（除個(gè)別樣本J9、Y5），但花樣本在該維度上都聚集在正值區(qū)域，遠(yuǎn)大于其余兩類，可以實(shí)現(xiàn)墨旱蓮花部位的區(qū)分。從主成分2軸分析，在此維度上花與莖交叉嚴(yán)重，個(gè)別葉樣本（Y7、Y11）也存在交叉的情況，總體上葉樣本在該維度大于其余兩類，可實(shí)現(xiàn)葉樣本的區(qū)分。因此，主成分1和主成分2可以作為墨旱蓮花、葉及莖的分類識(shí)別變量，能夠?qū)δ瞪徦幉牡牟煌幱貌课贿M(jìn)行分類及質(zhì)量評(píng)估。

表3 墨旱蓮藥材UPLC特征圖譜色譜峰各主成分貢獻(xiàn)率

圖4 墨旱蓮藥材UPLC特征圖譜色譜峰主成分分析二維投影

表4 11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖樣品綜合得分結(jié)果

圖5 11批墨旱蓮藥材及其花、葉、莖樣品主成分得分

2.6 5種成分含量測(cè)定

2.6.1 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得各成分回歸方程及線性范圍，見(jiàn)表5。

表5 5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6.2 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的墨旱蓮藥材（S4）約0.5 g，精密稱定，平行稱定6組，置具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品混合溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備并測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表6。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表6 5種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.3 樣品測(cè)定結(jié)果

取墨旱蓮藥材及其花、葉、莖樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備并測(cè)定，計(jì)算咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?？鼘幩帷Ⅲ豺嗑諆?nèi)酯含量，結(jié)果見(jiàn)表7。墨旱蓮不同藥用部位的5種成分含量差異明顯，花的平均總含量為9.71 mg/g，葉為6.69 mg/g，莖為1.19 mg/g，RSD為41.25%～115.12%。從成分含量均值看，咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岷烤鶠榛ǎ救~，蟛蜞菊內(nèi)酯含量花≈葉，莖的5種成分含量均低于同批次花和葉?？梢?jiàn)，墨旱蓮5種成分主要集中于花中，葉其次，莖中含量最低。

表7 墨旱蓮藥材及其不同藥用部位5種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

本研究對(duì)11批墨旱蓮藥材與花、葉、莖樣品進(jìn)行UPLC特征圖譜分析，確定9個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岷腕豺嗑諆?nèi)酯5個(gè)特征峰；并對(duì)11批墨旱蓮藥材與花、葉、莖樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，墨旱蓮?fù)凰幱貌课坏南嗨贫染?.88以上，表明不同批次藥材的同一藥用部位相似度良好。共有峰峰面積聚類分析結(jié)果表明，墨旱蓮不同部位UPLC特征圖譜聚類分析可將花、莖、葉部位區(qū)分開(kāi)，這與特征圖譜相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果一致。對(duì)共有峰進(jìn)行主成分分析，將9個(gè)共有峰變量降維成2個(gè)主成分變量，可將樣品分為三類，與相似度和聚類分析的結(jié)果一致。

墨旱蓮傳統(tǒng)采收經(jīng)驗(yàn)是在花期采收其包括花、葉莖的地上部分。目前對(duì)墨旱蓮的含量測(cè)定研究指標(biāo)性成分大多只選擇蟛蜞菊內(nèi)酯作為單指標(biāo)，未對(duì)墨旱蓮的花、葉、莖部位進(jìn)行分類研究。本研究選擇咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、蟛蜞菊內(nèi)酯5種指標(biāo)成分對(duì)墨旱蓮樣品進(jìn)行含量測(cè)定，分析更加嚴(yán)謹(jǐn)、全面。結(jié)果顯示，墨旱蓮花、葉和莖中5種成分含量差異明顯，花部位平均總含量為9.71 mg/g，葉為6.69 mg/g，莖為1.19 mg/g，其中咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岷烤鶠榛ǎ救~，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量花≈葉，而莖的5種成分含量均低于同批次的花和葉。綜上，墨旱蓮的各種成分主要集中于花中，葉其次，莖中幾乎沒(méi)有，花、葉、莖的比例對(duì)墨旱蓮藥材的質(zhì)量有明顯影響，與特征圖譜分析結(jié)果相符。本方法同時(shí)測(cè)定墨旱蓮5種成分含量及UPLC特征圖譜，結(jié)合墨旱蓮傳統(tǒng)采收經(jīng)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)墨旱蓮藥材質(zhì)量的合理控制。

本研究建立的墨旱蓮藥材及其花、葉、莖UPLC特征圖譜準(zhǔn)確度高、方法可靠、專屬性強(qiáng)，可同時(shí)測(cè)定墨旱蓮特征圖譜和多個(gè)指標(biāo)成分含量，為墨旱蓮分析方法和化學(xué)成分研究提供參考，并為墨旱蓮不同藥用部位分析提供依據(jù)。