姜廣坤，牛雯穎，張文娓，馮月男，劉 鑫，王曉源，丁 瑩

（1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 貴陽 550025；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心 哈爾濱 150040；3. 黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)系藥理教研室 哈爾濱 150040）

1 引言

在全球范圍內(nèi)，糖尿病已成為危害人們健康的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。多尿、多飲等癥狀被視為糖尿病的重要病態(tài)表現(xiàn)[1-2]。根據(jù)《中國2 型糖尿病防治指南》2017 版結(jié)果顯示[3]，2 型糖尿?。═2DM）占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，我國18 歲以上成人T2DM 發(fā)病率已達(dá)10.4%，男性11.1%，女性9.6%，60 歲以上的老年人罹患糖尿病的人數(shù)均在20%以上。因此，研究T2DM 的病理機(jī)制及防治的有效方法具有重要的意義和緊迫性。

在我國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，將糖尿病歸屬于“消渴病”癥，隨著中醫(yī)理論的不斷完善和臨證的日趨深入，陰虛與燥熱被認(rèn)為是消渴病（糖尿?。┑闹饕l(fā)病機(jī)制，兩者相互影響，互為因果[4]。中醫(yī)常以益氣養(yǎng)陰、清熱化瘀論治療糖尿病。連梅湯組方出處為《溫病條辨》卷三[5]，以黃連、烏梅（無核）、麥冬、生地、阿膠煎煮服用，具有清心瀉火、滋腎養(yǎng)液之功效。主治暑邪深入少陰、火灼陰傷、消渴引飲、暑邪深入厥陰、筋脈失養(yǎng)、手足麻痹等癥狀。研究表明，連梅湯可以從蛋白和基因水平通過MCP-1、SREBP-1c 及FAS 干預(yù)2 型糖尿病大鼠脂肪組織微炎癥反應(yīng)，同時(shí)也對糖尿病周圍神經(jīng)病變具有一定治療作用[6]。胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要特征[7]，深入分析中醫(yī)藥治療二型糖尿病胰島素抵抗的用藥規(guī)律，可為中醫(yī)臨床治療和新藥開發(fā)提供參考。同時(shí)，連梅湯在db/db自發(fā)2型糖尿小鼠中的治療作用還未見報(bào)道。

腸道菌群是指微生物在體內(nèi)長期停留在腸道內(nèi)，其組成和豐度可影響多種生理過程[8]。近年來，腸道微生物組成和含量的變化被認(rèn)為是影響許多疾病進(jìn)展的重要原因，如壞死性結(jié)腸炎和糖尿病等[9-10]。糖尿病是一種受人體代謝狀態(tài)影響的疾病，受到腸道菌群組成的影響[11]。腸道菌群可以進(jìn)一步影響體內(nèi)其他重要指標(biāo)的變化，從而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。且連梅湯對db/db 小鼠腸道微生物的影響也未見報(bào)道。因此，本研究首次通過db/db 糖尿病小鼠，測定血糖和血脂的水平，以及肝臟功能相關(guān)指標(biāo)。并通過分析實(shí)驗(yàn)小鼠腸道菌群的變化，驗(yàn)證連梅湯的治療效果及對腸道菌群的影響。

1 研究思路與方法

連梅湯按照低、中、高三個(gè)劑量連續(xù)灌胃小鼠14天，收集小鼠血液，肝組織和糞便，利用血生化途徑和HE 染色分別檢測小鼠血糖、肝功能指標(biāo)和組織病理改變，最后通過高通量測序獲得小鼠腸道菌群組成和多樣性分布（圖1）。通過上述方法驗(yàn)證連梅湯具有降糖、降脂和保肝的作用，并對腸道菌群具有一定調(diào)節(jié)能力。

圖1 連梅湯治療糖尿病小鼠流程圖。

2 研究與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 儀器與設(shè)備

血糖儀（魚躍，580 型），江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)（凱達(dá)，KH19A），湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；半自動(dòng)血生化分析儀（普朗，PUS-2018G），北京普朗新技術(shù)有限公司；分析電子天平（FA2004N），上海菁海儀器有限公司；制片染色一體機(jī)（奧華，KCT-10），孝感奧華醫(yī)療科技有限公司；熒光顯微鏡（匯光，RX50），江蘇匯光科技；無菌操作臺(tái)（SW-CJ-1FD），上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司。連梅湯藥材黃連、烏梅（無核）、麥冬、生地、阿膠購買于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。血糖試紙購買于魚躍（Yuwell）。蘇木精-尹紅染料購買于上海翊圣生物科技有限公司。糞便DNA試劑盒（D4015-02，Omega，Inc.，USA）。

2.1.2 試劑的制備

組成連梅湯的藥味和量分別為黃連6 g、烏梅9 g、麥冬9 g、生地9 g、阿膠6 g。將上述藥味合并在1 L 水中浸泡2 h 后開始煎煮，每副藥煎煮兩次，每次留取300 mL，合并濃縮至39 mL 體積，配制成濃度為1 g·mL-1母液（高劑量組）。使用無菌水對母液進(jìn)行稀釋，配制為0.5 g·mL-1的中劑量組藥液和0.25 g·mL-1的低劑量組藥液。鹽酸二甲雙胍片0.25 g/片，取3 片溶于30 mL蒸餾水中，配成0.025 g·mL-1的鹽酸二甲雙胍水溶液。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組及處理

C57BL/6J 和db/db 小鼠購買于達(dá)碩動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（川）2015-030；使用許可證號(hào)為SYXK（川）2014-189。本實(shí)驗(yàn)全部動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天，C57BL/6J 小鼠作為空白對照，db/db 模型小鼠30只，隨機(jī)分為5組，分別為對照組，二甲雙胍對照組，連梅湯高、中、低三個(gè)劑量治療組，每組6只?？瞻捉M、對照組按體重灌胃蒸餾水（10 mL·kg-1），對照組灌胃鹽酸二甲雙胍水溶液0.25 g·kg-1，連梅湯高、中、低劑量組給藥濃度分別為10、5、2.5 g·kg-1，連續(xù)給藥14天。

2.2.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)給藥14 天后禁食12 h，每組隨機(jī)選三只小鼠收集糞便并于液氮中儲(chǔ)存。當(dāng)完成實(shí)驗(yàn)時(shí)，處死小鼠，收集小鼠血液進(jìn)行血生化檢測和測量空腹血糖，收集肝臟組織HE染色實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 血生化檢測

采集小鼠靜脈血，在37℃條件下靜置30 min，高速離心（3000 r·min-1），離心5 min，收集血清，半自動(dòng)血生化分析儀檢測肝功能相關(guān)指標(biāo)。

2.2.4 微生物DNA提取測序及數(shù)據(jù)分析

總DNA 按照試劑盒說明書在離心柱上洗脫，-80℃保存，樣本在中國浙江省杭州市LC-BIO 技術(shù)（杭州）有限公司的PCR 中進(jìn)行測定。空白樣本由未使用的棉簽組成，經(jīng)過DNA 提取處理，測試不含DNA 擴(kuò)增子。對DNA 擴(kuò)增的16SV3-V4 區(qū)域進(jìn)行PCR，底物序列：前向底物為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向底物3′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′。樣品在Illumina MiSeq 平臺(tái)上測序，配對的reads 按照樣品唯一的條形碼進(jìn)行分配，并通過切斷條形碼和引物序列進(jìn)行截?cái)唷３蓪Φ膫?cè)讀使用FLASH（V1.2.8）進(jìn)行合并。根據(jù)fqtrim（v0.94），在特定的過濾條件下對原始標(biāo)簽進(jìn)行質(zhì)量過濾，獲得高質(zhì)量的干凈標(biāo)簽。Vsearch（V2.3.4）將相似度為97%的序列分配給同一個(gè)操作分類單元（operational classification unit, OTU）。為每個(gè)OTU 選擇一個(gè)有代表性的序列，然后使用RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目）分類器為每個(gè)有代表性的序列分配分類數(shù)據(jù)。

利用Mafft 軟件（V7.310）對不同類群優(yōu)勢種間的差異進(jìn)行多序列比對，研究不同OTU 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。OTUs 豐度信息按照最小序列樣本對應(yīng)的序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化。采用alpha 多樣性法，采用Chao1、Good′s Coverage、Shannon 和3 個(gè)指標(biāo)對樣本的多樣性復(fù)雜度進(jìn)行分析。我們的示例中的所有這些指標(biāo)都是使用QIIME（版本1.8.0）計(jì)算的。多樣性分析用于評價(jià)樣本物種復(fù)雜性的差異。采用QIIME 軟件（version 1.8.0）PCoA和聚類分析計(jì)算beta多樣性。

2.2.5 HE染色

連梅湯治療后第14 天處死小鼠。立即收集肝臟組織，4%的多聚甲醛固定3 天，脫水，制備5 μm 厚石蠟切片。蘇木精伊紅（HE）染色光鏡下觀察組織病理變化。顯微鏡下觀察肝臟組織的脂肪變性和空泡變性，評估肝臟組織的病理改變。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SigmaPlot（Systat 軟件Inc，美國）進(jìn)行分析。差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用學(xué)生t檢驗(yàn)確定，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 結(jié)果

2.4.1 連梅湯對糖尿病模型小鼠血糖和血脂的調(diào)節(jié)作用

與C57BL/6J 空白組比較，db/db 糖尿病對照組小鼠的空腹血糖、進(jìn)食后血糖、血清中FFA、血清中INS有顯著差異（P＜0.05）。與對照組比較，陽性藥二甲雙胍能夠顯著降低這些不良反應(yīng)。同時(shí)，不同濃度實(shí)驗(yàn)藥物連梅湯都對db/db 糖尿病小鼠的空腹血糖、進(jìn)食后血糖、血清中FFA、血清中INS 均有一定的抑制作用。與對照組比較，連梅湯高劑量能夠顯著降低血液游離脂肪和胰島素的水平（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 各組小鼠血糖、血清中FFA和INS濃度的變化（n=6，± SD）

表1 各組小鼠血糖、血清中FFA和INS濃度的變化（n=6，± SD）

注：模型組與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；其余組與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

檢測指標(biāo)空腹血糖進(jìn)食后血糖血清中FFA血清中INS空白組8.95±1.11 10.07±2.79 18.669±9.751 7.573±1.183對照組16.27±6.27*19.67±3.81*44.858±8.734**14.568±1.505**陽性藥11.53±0.79 13.13±1.01 27.370±8.404##11.076±4.189 #低劑量15.83±3.46 17.92±5.63 37.834±9.863 13.180±2.481中劑量15.53±2.52 15.78±2.30 36.164±5.543 12.538±2.869高劑量13.85±4.37 19.68±6.63 32.221±9.767#11.013±1.003#

2.4.2 連梅湯對糖尿病模型小鼠肝臟功能的影響

與空白組小鼠比較，對照組小鼠血清的TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c 水平顯著增加（P＜0.01），而TG水平維持穩(wěn)定（P＞0.05）。與對照組比較連梅湯能顯著下調(diào)ALT 的水平，且在低劑量組的下降率約為50%，中劑量組下降率約為30%。連梅湯治療組中TC、AST、HDL-c、LDL-c 在血液中的水平均在低劑量組處于最低，甚至比陽性藥治療組的效果更顯著（表2）。

表2 各組小鼠肝臟功能相關(guān)指標(biāo)的變化（n=6，± SD）

表2 各組小鼠肝臟功能相關(guān)指標(biāo)的變化（n=6，± SD）

注：模型組與空白組相比，*P＜0.05，***P＜0.001；其余組與模型組相比，#P＜0.05。

檢測指標(biāo)ALT TG LDL-C HDL-C TC AST空白組47.27±21.05 1.01±0.19 0.32±0.11 1.59±0.41 2.18±0.32 162.63±19.36對照組361.27±39.9***0.96±0.10 0.81±0.20 3.01±0.26 4.19±0.48*288.07±55.45*陽性藥225.67±86.17 0.94±0.17 0.74±0.21 2.95±0.36 4.18±0.53 357.63±42.68低劑量148.53±44.59#0.89±0.06 0.61±0.23 2.75±0.18#4.33±1.083 289.13±48.95中劑量191.83±44.59#0.85±0.06 0.78±0.18 2.62±0.38 3.81±0.56 230.35±77.85高劑量215.97±50.54#0.83±0.23 0.74±0.23 3.01±0.55 2.79±0.49#217.37±26.47#

2.4.3 連梅湯對糖尿病模型小鼠肝組織病理變化的保護(hù)作用

C57BL/6J 空白組小鼠肝臟組織被膜完整，肝小葉分葉不明顯，肝索排列較為整齊；中央靜脈內(nèi)皮完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態(tài)正常，未見明顯變性壞死。對照組則出現(xiàn)不同程度肝細(xì)胞壞死，見胞核固縮、崩解，胞質(zhì)溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變性。與對照組比較，陽性藥物及連梅湯不同劑量治療組則未見明顯病理改變。黃色箭頭所指為肝細(xì)胞空泡突變，藍(lán)色箭頭所指為脂肪變性處（圖2）。

圖2 連梅湯水煎液對C57BL/6J和db/db糖尿病模型小鼠肝臟組織形態(tài)變化影響。

2.4.4 連梅湯對糖尿病模型小鼠腸道菌群組成的影響

各組小鼠在門水平和屬水平的腸道菌群組成如圖3A和圖3B。在門水平，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）等為主要的優(yōu)勢菌群，相對豐度較高。在門水平，相較于空白組、對照組，不同劑量的連梅湯均可以顯著提高擬桿菌的豐度，而對厚壁菌門則有一定的抑制作用。在屬水平，連梅湯治療組可以顯著抑制腸桿菌、酵母菌的量，同時(shí)降低了腸道微生物的相對豐度。如下圖3C所示，在門水平厚壁菌門在連梅湯低劑量含量最低，擬桿菌門對連梅湯的響應(yīng)具有劑量依賴的關(guān)系。然而，放線菌門（Actinobacteria）則在空白組和對照組以及連梅湯的治療下并未出現(xiàn)明顯的規(guī)律。如下圖3D所示，屬水平的菌群大都對連梅湯具有明顯的響應(yīng)，連梅湯對乳桿菌（Lactobacillus）的含量具有顯著的抑制作用，對顫螺菌屬（Oscillospira）的生長繁殖具有促進(jìn)作用。擬桿菌屬（Bacteroides）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）、普氏菌（Prevotella）等在灌胃連梅湯的小鼠腸道內(nèi)的水平均出現(xiàn)不同程度的增加。以上結(jié)果表明C57BL/6J小鼠和db/db糖尿病模型小鼠在門水平腸道微生物結(jié)構(gòu)上無明顯差異，在屬水平上也差異較小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連梅湯在門和屬水平都對腸道微生物有明顯的調(diào)節(jié)作用，能顯著改變菌群的相對豐度，并對擬桿菌門和乳酸菌屬影響顯著。

圖3 菌群組成分析

2.4.5 連梅湯對糖尿病模型小鼠腸道菌群多樣性的影響

本實(shí)驗(yàn)通過Alpha 多樣性反映連梅湯對糖尿病小鼠微生物群落的豐度和多樣性影響。連梅湯治療組Chao1 指數(shù)大于空白組和對照組，表明菌群數(shù)越多。Shannon 指數(shù)反映菌群的多樣性，Shannon 指數(shù)越大菌群多樣性越高。6組樣本中空白組Shannon指數(shù)最小，連梅湯中、高劑量組較高。以上結(jié)果表明，連梅湯對調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群多樣性有顯著效果，這有可能是連梅湯中的降糖成分發(fā)揮了積極作用（圖4A）。Beta 多樣性通過主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），橫坐標(biāo)為Axis1，貢獻(xiàn)率為11.5%，縱坐標(biāo)為Axis2，貢獻(xiàn)率為9%，可以代表大部分變量信息。PCoA 在空白組與對照組之間分布呈顯著離散分布，而連梅湯治療組中低、劑量之間高度聚攏，表明連梅湯中、低劑量這兩組在相應(yīng)維度中的群落組成十分相似（圖4B）。

圖4 菌群多樣性分析

3 討論

隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生了巨大的變化，尤其是飲食習(xí)慣。飲食中鹽、糖和脂肪的過量攝入導(dǎo)致慢性代謝性疾病，如肥胖和糖尿病的發(fā)病率增加。糖尿病已成為我國日益突出的社會(huì)健康問題，T2DM 帶來的健康問題尤為嚴(yán)重，T2DM 在糖尿病前期人群中的發(fā)病率高達(dá)35.5-70.4/1000 人/年[12]。因此，本研究以傳統(tǒng)中醫(yī)藥為突破口，使用經(jīng)典方劑連梅湯對db/db 糖尿病模型小鼠進(jìn)行治療。在實(shí)驗(yàn)期間，可以觀察到連梅湯治療組降低了db/db 小鼠的血糖和血脂，同時(shí)也對糖尿病小鼠的肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。其次，通過16SrDNA 高通量測序發(fā)現(xiàn)，連梅湯雖然使模型小鼠的豐度下降了，但卻增加了腸道的微生物種類。

糖尿病（消渴癥）在傳統(tǒng)中醫(yī)典籍里已經(jīng)有較多報(bào)道，晉朝的陳延之在《小品方》就已經(jīng)提出消渴病尿甜為腎氣不固、精微下流所致[13]。隋代的甄立言在《古今錄驗(yàn)方》不僅提出了消渴病尿甜的現(xiàn)象，而且還對消渴病、消中、腎消進(jìn)行了鑒別[14]。連梅湯以酸甘化陰，苦味堅(jiān)陰為基調(diào)，具有清心瀉火，滋腎養(yǎng)液的功效。將連梅湯應(yīng)用到糖尿?。ㄏ拾Y）的治療中，已被大量現(xiàn)代醫(yī)家報(bào)道。因此，通過調(diào)控腸道菌群的組成在T2DM 的治療過程中起著相當(dāng)重要的作用，為中藥治療疑難雜癥提供了新的思路。目前，已有現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究證實(shí)腸道菌群與T2DM 反應(yīng)密切相關(guān)[9]。Membrez 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，諾氟沙星和氨比西林對飲食誘導(dǎo)肥胖（DIO）小鼠血糖得到控制，空腸TNF-α 水平降低，提示抗生素對腸道菌群的調(diào)節(jié)可降低炎癥反應(yīng)水平，增加糖耐量。其抗生素治療T2DM 的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)胰島A 細(xì)胞膜上γ-氨基丁酸A 型受體（GABAA）的活性，抑制胰高血糖素的分泌進(jìn)而控制血糖。但抗生素屬于易過敏藥物，不良反應(yīng)較多，且容易產(chǎn)生耐藥性?；谝陨辖Y(jié)論，通過傳統(tǒng)中藥減輕西藥使用過程中的副作用，顯得很有必要。

T2DM 嚴(yán)重影響患者身體健康，并伴有脂代謝紊亂等一系列的疾病[16]。T2DM 病人常伴有脂肪肝、膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、空腹胰島素、C-肽水平明顯增高，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇LDL-C 則無顯著變化[17-18]。與上述結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)中在連梅湯的治療作用下，膽固醇和甘油三酯的水平均有不同程度的降低。肝臟作為脂類的消化、吸收、運(yùn)輸、分解代謝和合成代謝的工廠，與脂代謝密切相關(guān)[19]。在連梅湯的治療下db/db 小鼠肝臟組織病理變化得到恢復(fù)。同時(shí)，腸道菌群已被報(bào)道與脂代謝和肥胖具有密切的聯(lián)系，肥胖患者存在腸道菌群異常，出現(xiàn)厚壁菌門增加，擬桿菌門減少，將肥胖型小鼠腸道菌群接種于無菌小鼠，無菌小鼠體重明顯增加，說明腸道菌群能夠影響宿主的代謝[20-21]。灌胃連梅湯的db/db 小鼠出現(xiàn)了厚壁菌門含量降低，擬桿菌門水平升高，這說明連梅湯對脂代謝是具有促進(jìn)作用。本研究針對2 型糖尿病，旨在通過調(diào)整腸道菌群失衡來改善宿主代謝，探討連梅湯對db/db 小鼠菌群紊亂及脂代謝異常的恢復(fù)作用，為T2DM 的治療提供參考。

4 結(jié)論

綜上所述，連梅湯具有降糖、降脂和保肝的作用，可以顯著改善T2DM 小鼠的血糖、血脂代謝紊亂，并能減輕肝臟損傷。連梅湯對糖尿病的治療效果確切，其發(fā)揮功能的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)，但其具體機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究去驗(yàn)證其治療機(jī)制。通過連梅湯探索傳統(tǒng)中藥對于防止糖尿病和糖尿病誘發(fā)的動(dòng)物肝臟病變具有重要的臨床意義，值得在今后的研究中進(jìn)一步探討。