張博承，彭 立，＊＊，許 滔，郭磊磊，，謝 靜，周玉萍，駱胤堯，肖瓊艷，楊雙雙，巫廷春，殷念念

（1. 貴州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 貴陽 550002；2. 貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 貴陽 550001）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。┦怯捎诠跔顒用}狹窄或堵塞，導致供血心肌缺血缺氧甚至壞死的嚴重缺血性心血管疾病，在病理上是一種以膽固醇沉積和慢性炎癥反應為特點的心血管疾病[1]。冠心病是危害人類健康的重大疾病之一。根據(jù)2018 年中國心血管病報告，我國心血管病患病人數(shù)已達2.9億，其中冠心病1100 萬，已成為重大的公共衛(wèi)生問題[2]。冠心病具有高發(fā)病率、高致死率的特點，目前冠心病的治療主要包括抗血小板聚集、降低血脂、抑制交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，而缺乏針對冠心病慢性炎癥反應機制的治療。因此，尋找有效的干預冠心病慢性炎癥反應機制的藥物并闡明其作用途徑和靶點對于冠心病的防治具有重要的臨床意義。

輔助性T 細胞17（T helper cell 17,Th17）是一種能分泌白介素17（interleukin 17, IL-17）的T 細胞亞群，其存在于小鼠和人類的動脈粥樣硬化病變中，具有強烈的促進炎癥反應作用，可加速粥樣硬化斑塊進展和導致斑塊穩(wěn)定性下降[3-5]。因此，Th17細胞分化在冠心病中致為關鍵，在慢性炎癥情況下，IL-6 大量產生，促進CD4+T 細胞向Th17 分化，同時抑制調節(jié)性T 細胞的產生，介導機體的前炎癥反應。已知與Th17細胞分化密切相關的兩條通路，即TGFβ 信號通路和JAK/STAT信號通路，通過直接或間接作用促進Th17細胞分化。

冠心病屬于中醫(yī)胸痹心痛病范疇，其主要的病理因素分為虛實兩方面，其中氣虛和血瘀是最主要的兩個證候要素，氣虛血瘀證型也是最常見和最主要的證型。芪參益氣滴丸（Qishen Yiqi pill,QSYQ）是臨床治療冠心病心絞痛、心肌梗死、心力衰竭的現(xiàn)代中藥，其主要成分包括黃芪、丹參、三七、降香油，具有益氣通脈、活血止痛的作用[6-7]。我們的前期研究顯示，芪參益氣滴丸可通過減少斑塊和脾臟中IL-17的蛋白表達從而抑制動脈粥樣硬化。但對Th17 細胞分化的作用途徑和靶點需要進一步研究。本研究以Th17 細胞分化為研究對象，首先通過網絡藥理學方法分析芪參益氣滴丸有效成分作用于Th17 細胞分化的作用途徑和靶點，其次證實芪參益氣滴丸抑制粥樣硬化斑塊的作用及對TGFβ 信號通路和JAK/STAT 信號通路關鍵蛋白的作用，從而闡明芪參益氣滴丸治療冠心病的抗炎機制，為臨床應用芪參益氣滴丸治療冠心病提供科學支撐。

1 材料和方法

1.1 網絡藥理學實驗

1.1.1 芪參益氣滴丸溶出成分分析

根據(jù)芪參益氣滴丸高效液相色譜-質譜研究發(fā)現(xiàn)，19 種化合物在260 nm 處有較強的紫外吸收，27 種化合物在203nm 處有微弱的紫外吸收[8]。并使用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對其化合物名稱和分子結構進行核對。

1.1.2 芪參益氣滴丸有效成分篩選

選擇芪參益氣滴丸46種成分作為目標化學成分，去除未知成分及非藥物成分，按照化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 或已有文獻報道進行篩選（https://tcmsp-e.com/）。

1.1.3 構建芪參益氣滴丸有效成分—Th17 細胞靶標網絡

將篩選得到的芪參益氣滴丸有效成分通過逆向分子對接（使用invdock 和autodock-vina 軟件，來源National University of Singapore 和http://vina.scripps.edu/），進而找到相對應的靶標，并進行KEGG 通路富集分析（http://www.bioinformatics.com.cn/），構建芪參益氣滴丸有效成分—Th17 細胞靶標網絡（http://www.genome. jp/kegg/）。 采 用Cytoscape 軟 件（https://cytoscape.org/）進行網絡構建、分析和可視化工作。

1.2 動物實驗

1.2.1 儀器與試劑

電子天平（型號：ME104E/02，梅特勒托利多儀器上海有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（型號：DGG-9203A，上海森信實驗儀器有限公司），冰凍切片機（型號：CM 1950，德國Leica Biosystems Nussloch GmbH），倒置顯微鏡（型號：IX53，日本OLYPUS Corporation），圖像拍攝系統(tǒng)（型號：cellSens Standard 1.9，日本OLYPUS Corporation），酶標儀（型號：ZS-3 板式酶標儀，北京市新風機電技術公司），電泳儀（型號：DG-300C，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），迷你雙垂直電泳槽（型號：DYCZ-24DN 型，北京市六一儀器廠），水平搖床（型號：TDK-2 水平搖床，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），臺式高速冷凍離心機（型號：TGL-20M型，長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

RIPA 裂解液（貨號：WB-0071，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），PMSF（貨號：WB-0181，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：BCA01，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），1.5M Tris-HCL pH8.8（貨號：WB-0011，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），1.0M Tris-HCL pH6.8（貨號：WB-0021，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），30% Acrylamide 丙烯酰胺（貨號：WB-0031，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），SDS 十二烷基硫酸鈉（貨號：DH286-1.1，GenView 分裝），考馬斯亮藍R-250（貨號：DH078，USB 公司），Ponceau S麗春紅（貨號：DH256-1，GenView 分裝），PVDF 轉印膜（貨號：XLL092-2，PALL 公司），ECL 化學發(fā)光試劑盒（貨號：ECL-0012，PIERCE 公司），通用顯影粉（貨號：XLL039-1，天津市世紀奧博商貿有限責任公司），通用定影粉（貨號：XLL040，天津市世紀奧博商貿有限責任公司）。

芪參益氣滴丸（規(guī)格：0.5 g/袋，批號：140706，天士力制藥股份有限公司），蘇丹IV（規(guī)格：500 g/瓶，貨號：85-83-6，沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司），抗轉化生 長 因 子β 受 體1（Transforming growth factor beta receptor 1，TGF-βR1）抗體（貨號：GTX102784，稀釋比例：1:500，GeneTex 公司），抗Sma 與Mad 相關蛋白2/3（Sma-and Mad-related protein 2/3，Smad2/3）抗體（貨號：SC-8332，稀釋比例：1:500，SANTA 公司），抗Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗體（貨號：ab32101，稀釋比例：1:5000，Abcam 公司），抗信號轉導和轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription，STAT3）抗體（貨號：ab76315，稀釋比例：1:10000，Abcam 公司），抗維甲酸相關孤兒受體α（Retinoidrelated orphan receptor α，RORα）抗 體（貨 號：GTX100029，稀釋比例：1:2000，GeneTex 公司），抗維甲酸受體α（Retinoic acid receptor α，RARα）抗體（貨號：ab76074，稀釋比例：1:500，Abcam 公司），抗β-肌動蛋白（β-Actin）抗體（貨號：AC001-M，稀釋比例：1:5000，SANTA公司）。

1.2.2 動物

健康雄性SPF 級ApoE 基因敲除小鼠（品系C57BL/6J），7 周齡，體質量21-23 g，購自北京華阜康生物科技股份公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0004。小鼠飼養(yǎng)于22℃和50%相對濕度的空調環(huán)境中，12 h 光照與12 h 黑暗循環(huán)。動物實驗過程獲得貴州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。所有的動物處置都符合國際實驗動物照料和使用指南[9]。

1.2.3 實驗設計

ApoE基因敲除小鼠分為三組：模型組（Model）、芪參益氣滴丸低劑量組（QSYQ low）、芪參益氣滴丸高劑量組（QSYQ high），每組各6只小鼠。各組小鼠均于實驗第1 天給予高脂飼料喂養(yǎng)（高脂配方：基礎飼料79%，豬油21%，膽固醇0.15%。購自北京博泰宏達生物技術有限公司），持續(xù)喂養(yǎng)8周。芪參益氣滴丸治療組于實驗第1天給予低劑量或高劑量的藥物（0.3 g/kg/天或1.5 g/kg/天），模型組給予等體積的生理鹽水。給藥8 周后取材，用10%水合氯醛（貨號：302-17-0，Merck 公司）進行腹腔注射，收集腹主動脈血液并處死小鼠，再經心臟灌注20 mL 的1×PBS（貨號：17202，Millipore公司）后取出心臟和主動脈。

1.2.4 病理形態(tài)學染色及測量

為了評價各組動脈粥樣硬化損傷程度，我們將主動脈根部包埋于最佳切割溫度復合物（Optimal cutting temperature compound，OCT）冰凍切片包埋劑中，并儲存于-80℃超低溫冰箱中。然后對主動脈根部行連續(xù)冰凍切片（10 μm），每隔10 張切片進行蘇丹IV 染色，采用圖像拍攝系統(tǒng)在100 倍和400 倍鏡下進行攝片，用Image J軟件定量測量動脈粥樣硬化損傷面積，各組按主動脈根部每隔100μm 切片的陽性染色面積進行比較。

1.2.5 蛋白質免疫印跡實驗

將主動脈研碎，使用RIPA 裂解液，裂解液中加入PMSF（1 mM），對主動脈細胞進行裂解，然后將蛋白質提取物置于放射免疫沉淀分析緩沖液中進行分離，蛋白質濃度采用二喹啉甲酸方法進行測量（在振蕩器上振蕩30 s，37℃放置30 min，然后在562 nm 下測定OD值）。蛋白質上清液（80 μL）在10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠上進心電泳分離（恒壓80 V 預電泳10 min 至溴酚藍前沿到達分離膠，將電壓調整到恒壓

120V，電泳直至溴酚藍到達分離膠底部），然后轉移到硝化纖維素膜上。目標蛋白質采用抗靶標蛋白抗體進行孵育（室溫下?lián)u床緩慢搖蕩孵育1-3 h 或者4℃過夜孵育），然后用相應二抗進行孵育（室溫搖床孵育2 h）。增強化學發(fā)光成像法用于蛋白質條帶的檢測。使用Quantity One 軟件進行半定量分析，數(shù)據(jù)用目標蛋白/β-actin的比值表示。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異（Least significant difference，LSD）法，統(tǒng)計軟件為統(tǒng)計產品與服務解決方案11.5（Statistical Product and Service Solutions 11.5，SPSS 11.5），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芪參益氣滴丸有效成分及作用靶點數(shù)量

我們根據(jù)芪參益氣滴丸高效液相色譜-質譜研究結果確定其主要成分，并使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對其化合物名稱和分子結構進行核對，根據(jù)口服利用度（OB）、類藥性（DL）或已有文獻報道篩選出有效成分，包括黃芪甲苷、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素7-羥基-4′-甲氧基異黃酮等11 個成分（表1）。將芪參益氣滴丸有效成分跟人類和哺乳動物的蛋白質庫進行經過逆向分子對接，哺乳動物的對接得到的蛋白質根據(jù)blast 對比到人類的蛋白質庫中。結果分為三組，一組是只有在invdock 中對接到的蛋白，一組是只有在autodock-vina 中對接上的蛋白，一組是invdock 和autodock-vina 結果相互重合的部分（結果最準確）。各成分最終靶點數(shù)量分別為114、29、28、25、17、13、29、35、31、14、21（表2）。

表1 芪參益氣滴丸中篩選出的化合物基本信息

表2 芪參益氣滴丸有效成分及作用靶點數(shù)量

2.2 芪參益氣滴丸有效成分對Th17 細胞分化通路的影響

我們選擇芪參益氣滴丸11 個有效成分作為目標化學成分，從Pubchem 數(shù)據(jù)庫下載這些成分的化學結構，通過逆向分子對接找到相對應的靶標，并進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析（圖1），構建芪參益氣滴丸有效成分—Th17 細胞靶標網絡（hsa04659）。結果顯示，25 個與Th17 細胞分化相關蛋白被確認為靶點蛋白，其中作用成分超過10 個的靶點蛋白有：CD4、TGFβR、SMADs、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、RARα、維甲酸X 受體（Retinoic acid X receptor，RXR）。多條信號通路，如TGF-β 信號通路、JAK/STAT 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、低氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1）信號通路、鈣信號通路、核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路等參與了芪參益氣滴丸干預Th17 細胞分化過程（圖2、表3）。

圖1 芪參益氣滴丸有效成分作用靶點KEGG通路富集圖

圖2 芪參益氣滴丸有效成分對Th17細胞分化通路的作用靶點

表3 芪參益氣滴丸作用于Th17細胞分化通路關鍵蛋白的成分數(shù)量及名稱

2.3 芪參益氣滴丸對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積的影響

為了評價芪參益氣滴丸對動脈粥樣硬化進展的影響，我們對動脈粥樣硬化小鼠主動脈根部進行蘇丹IV 染色及定量分析，各組每隔100 μm 切片的陽性染色面積進行比較（圖3）。結果顯示，模型組小鼠在主動脈根部形成粥樣硬化斑塊，內膜明顯增厚，含有大量脂滴沉積，結構較為疏松，斑塊面積約為80-180×103μm2。在主動脈根部100 -300μm 距離上，芪參益氣滴丸低劑量、高劑量均能明顯減小斑塊絕對面積（與模型組比較P＜0.05），而且呈現(xiàn)一定的劑量依賴特征，但在400 μm距離上，芪參益氣滴丸高、低劑量組在減少斑塊面積上無明顯差異，考慮與400 μm處斑塊距脂質核心較遠、脂肪含量少有關。

圖3 芪參益氣滴丸對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積的影響

2.4 芪參益氣滴丸對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化中Th17細胞靶點蛋白表達的影響

Th17 細胞的主要效應細胞因子是IL-17，通過促進單核-巨噬細胞侵入動脈壁從而加速動脈粥樣硬化進程[19]。我們選擇了已知與Th17 細胞分化密切相關的兩條通路TGFβ 信號通路、JAK/STAT 信號通路進行蛋白表達驗證（圖4）。結果顯示，模型組中TGFβR1/Smad2/3、JAK2/STAT3、RORα、RARα 等蛋白均有明顯表達。與模型組相比，芪參益氣滴丸低劑量組和高劑量組均可增加粥樣硬化動脈中TGFβR1 的表達（P＜0.05），芪參益氣滴丸高劑量組還可增加Smad2/3 的蛋白表達（P＜0.05），提示芪參益氣滴丸可通過促進TGFβR1/ Smad2/3 信號通路間接減少CD4+ T 細胞向Th17細胞分化。同時，芪參益氣滴丸高低劑量組與模型組比較均可抑制JAK2、STAT3、RORα 的蛋白表達（P＜0.05），但對RARα 的表達無顯著影響（P＞0.05），提示芪參益氣滴丸通過抑制JAK2/STAT3 信號通路直接減少CD4+T細胞向Th17細胞分化。

圖4 芪參益氣滴丸對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化中Th17細胞靶點蛋白表達的影響

3 討論

本研究探討芪參益氣滴丸對動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠模型的作用，結合網絡藥理學技術、病理學技術、分子生物學技術等，首次證實了芪參益氣滴丸抑制粥樣硬化斑塊中Th17 細胞的信號途徑和作用靶點，從而闡明其抑制動脈粥樣硬化的作用機制。

芪參益氣滴丸抗動脈粥樣硬化機制包括：降低血脂，升高肝組織肝酯酶活性，降低高敏C 反應蛋白水平，上調TGF-β1 表達等[20-22]。我們的前期研究顯示，芪參益氣滴丸可顯著減少動脈粥樣硬化小鼠肝指數(shù)、抑制斑塊中CD36 表達、增加肝臟X 受體α（Liver X receptor-α,LXR-α）、ATP 結合盒子系列G 成員5 表達（ATP-binding cassette transporter G member 5，ABCG5），促進膽固醇從肝臟排泄，其抑制粥樣硬化作用還與增加斑塊中調節(jié)性T細胞關鍵蛋白叉頭狀轉錄因子3（Forkhead transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）表達、減少Th17 細胞IL-17 細胞因子表達有關[23]。本研究證實，不同劑量芪參益氣滴丸均可顯著抑制動脈粥樣硬化小鼠主動脈根部粥樣硬化斑塊的面積，而且呈現(xiàn)一定的劑量依賴特征。

Th17 細胞是由幼稚型CD4+T 細胞分化而來。在TGF-β 單獨的作用下，活化的幼稚型CD4+T細胞分化為調節(jié)性T 細胞，而在TGF-β 和IL-6 的共同誘導，通過STAT3 向Th17 分化[24-27]。Th17 產生的主要效應因子是IL-17，IL-17 可誘導促炎細胞因子（如IL-6，TNF-α 等）、趨化因子（如巨噬細胞趨化蛋白-1）和基質金屬蛋白酶的表達。在動脈粥樣硬化條件下，血清IL-17 水平顯著升高，而氧化低密度脂蛋白通過增加IL-6 的分泌，誘導了樹突狀細胞介導的Th17 細胞極化，提示促動脈粥樣硬化因素可促進Th17 的炎癥功能[3,28-29]。動物實驗證實，Th17 細胞的比例在動脈粥樣硬化小鼠中明顯增高，而其表達的IL-17 和維甲酸相關孤兒受體γt在斑塊動脈顯著高于非斑塊動脈[30]。利用肺炎衣原體磷脂酶D 刺激可以通過誘導化學因子和粘附分子的表達，進而促進Th17 細胞的遷移和IL-17 的分泌，加速動脈粥樣硬化進展[31]，而通過阻斷IL-17A 可以明顯減少循環(huán)IL-6 和集落刺激因子水平，并抑制動脈趨化因子配體1 的表達和巨噬細胞的浸潤，減輕動脈粥樣硬化損傷程度[32]。

芪參益氣滴丸作為現(xiàn)代中藥復方，組成藥物多，成分復雜，我們采用網絡藥理學方法，確定了其主要有效成分，再利用逆向分子對接技術，找到了其影響Th17 細胞分化的作用靶點。25 個與Th17 細胞分化相關蛋白被確認為靶點蛋白，多條信號通路參與了芪參益氣滴丸干預Th17 細胞分化過程。其中，已知與Th17 細胞分化密切相關的兩條通路：TGFβ 信號通路和JAK/STAT 信號通路，其關鍵蛋白TGFβR1、Smad2/3、JAK2、STAT3、RORα 被證實可被芪參益氣滴丸調節(jié)。芪參益氣滴丸可通過兩條途徑減少Th17 細胞數(shù)量：一是促進TGFβR1/Smad2/3 蛋白表達，促使CD4+T細胞更多的向調節(jié)性T 細胞分化，間接減少Th17 細胞數(shù)量；二是通過抑制JAK2/STAT3 蛋白表達，直接減少CD4+T細胞向Th17細胞分化。

綜上所述，芪參益氣滴丸可通過干預TGFβ 信號通路和JAK/STAT信號通路，減少Th17細胞分化，抑制Th17 細胞主要效應因子IL-17 的分泌，抑制粥樣硬化斑塊炎癥反應及脂質沉積。