鄧志鵬，張 喆，周紅燕，劉 謙，張永清，韓利文

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 濟(jì)南 250062）

異綠原酸C（isochlorogenic acid C, 結(jié)構(gòu)見圖1）又名4,5-二咖啡?？鼘幩?，是在一分子奎寧酸的基礎(chǔ)上引入了二個(gè)咖啡?；Y(jié)合而成的化合物，屬于二咖啡?？鼘幩犷?。自然界中，忍冬科的金銀花、菊科的甜葉菊、蒼耳、燈盞細(xì)辛等多種藥用植物均含有異綠原酸類化合物，資源豐富[1]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)異綠原酸類化合物進(jìn)行了深入研究，在從植物中提取出異綠原酸成分的基礎(chǔ)上，對(duì)其生物活性、臨床價(jià)值以及應(yīng)用前景進(jìn)一步拓展研究，以便更好地造福人類[2-4]。研究表明，異綠原酸類化合物具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌、抗病毒等藥理作用，能顯著抑制HBV 的復(fù)制，具有保肝和免疫調(diào)節(jié)作用，并可改善乙型肝炎病毒引起的肝臟損傷，可用于治療肝炎[5]。臨床上，異綠原酸類化合物可用于降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制組胺釋放、抗纖維化、抑制平滑肌收縮、治療急性肺損傷，具有良好的應(yīng)用前景[6-11]。此外，異綠原酸類化合物可發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化、減輕自由基對(duì)生物膜的損傷等作用，用于腦中風(fēng)等疾病治療[12-15]。

圖1 異綠原酸C化學(xué)結(jié)構(gòu)

藥物經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄等過程，被血液運(yùn)輸至作用部位，達(dá)到一定作用濃度后產(chǎn)生特征性藥理作用。異綠原酸C經(jīng)灌胃進(jìn)入大鼠體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布之后，在代謝酶作用下異綠原酸C 化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，即發(fā)生代謝[16]，此過程既是藥物在機(jī)體最主要的消除方式，同時(shí)也是唯一導(dǎo)致外源性物質(zhì)發(fā)生質(zhì)變的過程。中藥成分的代謝主要發(fā)生在肝臟，藥物在肝臟部位經(jīng)I 相和II 相代謝后得到易排除體外的代謝物，但也有部分藥物代謝發(fā)生在腎、脾、肺、皮膚等器官[17]，以及腸內(nèi)[18]。

異綠原酸C 的生物利用度很低，但是其具有顯著的生物學(xué)活性，推測(cè)其活性成分可能為代謝產(chǎn)物[19]，經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知代謝物可能具有藥理活性、毒性或引起藥物與藥物間相互作用。研究表明，代謝產(chǎn)物的鑒定在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段具有重要指導(dǎo)作用[20,21]。本實(shí)驗(yàn)為全面了解異綠原酸C 及其體內(nèi)代謝情況，采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 聯(lián)用技術(shù)，利用Wistar 大鼠動(dòng)物體內(nèi)模型，分析灌胃給藥異綠原酸C后，考察血漿、尿液與糞便中的異綠原酸C的代謝產(chǎn)物情況，并推測(cè)體內(nèi)的代謝途徑，對(duì)于研究異綠原酸C作用機(jī)制具有重要參考價(jià)值，以及為研發(fā)新型藥物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠5只，體質(zhì)量：200±20 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）2019 0003。本研究獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)IACUC20210407003）。

1.2 藥品和試劑

對(duì)照品異綠原酸C（批號(hào)Y-070-180515，純度≥98%）購(gòu)自成都標(biāo)純化植有限公司（成都，中國(guó)）。乙腈、甲純、甲酸均為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 儀器

2.4.2 質(zhì)譜條件

2 方法

2.1 藥物制備

精密稱取異綠原酸C 粉末適量，置于10 mL 量瓶中，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶解，定容至刻度，配制成2.0 mg·mL-1異綠原酸C 溶液，供大鼠灌胃使用，其溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 樣品采集

2.2.1 血漿樣品的采集

將5 只雄性Wistar 大鼠作為給藥組，首先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天（22±2℃），于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，但自由飲水。給藥組按20 mg·kg-1劑量給予異綠原酸C 溶液，分別于給藥前及給藥后0.5、1、2、4、8 h 于大鼠眼眶靜脈叢取血，每次約0.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，靜置15 min，然后在3000 rpm條件下離心10 min，取淡黃色上清液，于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 尿液樣品和糞便樣品的采集

雄性Wistar 大鼠5 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，將大鼠置于代謝籠中禁食12 h，自由飲水，收集空白尿液和空白糞便。大鼠灌胃給予異綠原酸C 后，收集0-12 h、12-24 h、24-48 h 的尿液及0-48 h 糞便。尿液合并后以3000 rpm 離心10 min，取上清液于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩＜S便合并后在低于50℃條件下烘干后碾碎，于離心管中在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品處理

分別取血漿200 μL、尿液樣品1 mL、糞便樣品（稱取糞便樣品200 mg，碾碎研磨，加入1 ml甲醇，超聲10 min 使其溶解，11000 rpm 離心5 min，取出上清液）1 mL，用8 倍量乙腈沉淀蛋白，在11000 rpm 離心10 min，取上清液，溫和的氮?dú)庀麓蹈?。殘?jiān)屑尤?.1%甲酸水溶液-乙腈（95:5,v/v）溶液100 μL 超聲溶解，離心后取樣進(jìn)行分析。

2.4 樣品檢測(cè)

2.4.1 色譜條件

父母應(yīng)該引導(dǎo)孩子不要非常強(qiáng)烈地在乎細(xì)節(jié)上的對(duì)和錯(cuò)，因?yàn)閷?duì)錯(cuò)往往是相對(duì)的。對(duì)于孩子做的事情，父母也不要總用對(duì)錯(cuò)來分析。

在小學(xué)語(yǔ)文的教學(xué)工作中，不僅僅只是老師與學(xué)生的事情，還是老師與老師的事情。所以在小學(xué)語(yǔ)文的教學(xué)以及管理上，教師之間要積極進(jìn)行溝通與交流，這樣可以從中獲取一定的經(jīng)驗(yàn)，而且有利于提高教師的教育能力，加強(qiáng)師德建設(shè)。但是在現(xiàn)實(shí)教學(xué)中，很多教師都忽略了師師之間相互交流的重要性，在小學(xué)語(yǔ)文的教學(xué)中都是各顧各的，互相不交流經(jīng)驗(yàn)，生怕別人學(xué)去了一樣。這樣的現(xiàn)象是十分不利于師德建設(shè)工作的開展的，也在一定的程度上影響了教師的專業(yè)化發(fā)展。所以說在小學(xué)語(yǔ)文的教學(xué)中，教師不僅僅要注重教學(xué)質(zhì)量，還要注重教師之間的交流，促進(jìn)教師之間的共同進(jìn)步。

3.1.3 代謝產(chǎn)物M2結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

Thermo Scientific 超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap 高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；EL204電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；WD-12氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

離子源為電噴霧離子化源；離子源溫度為320℃；電離源電壓為3.3 kV；檢測(cè)模式為負(fù)離子模式；掃描質(zhì)量范圍為m/z50-1000；鞘氣為氮?dú)猓兌龋?9.99%），流速為45 Arb；輔助氣為氮?dú)猓兌龋?9.99%），流速為10 Arb。

2.5 數(shù)據(jù)采集與處理

血漿、尿液及糞便樣品預(yù)處理后，利用UPLC-QExactive Plus Orbitrap 高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Thermo Xcalibur Qual Browser 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰提取、質(zhì)譜碎片離子峰匹配分析。

校企共同成立教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控管理機(jī)構(gòu)，負(fù)責(zé)教學(xué)質(zhì)量保障體系的組織運(yùn)行與實(shí)施、信息整理與反饋。依托網(wǎng)絡(luò)教學(xué)綜合服務(wù)平臺(tái)，建立持續(xù)改進(jìn)的質(zhì)量保障體系，深入推進(jìn)教學(xué)模式、教學(xué)考核評(píng)價(jià)和資源體系改革，全面落實(shí)以學(xué)生為中心的個(gè)性化培養(yǎng)體系，真正實(shí)現(xiàn)“以學(xué)為主”的教學(xué)模式轉(zhuǎn)變。建立學(xué)業(yè)動(dòng)態(tài)預(yù)警機(jī)制，讓學(xué)生能夠及時(shí)正視自身問題，分析并進(jìn)行改正。通過畢業(yè)生就業(yè)發(fā)展跟蹤、用人單位反饋和第三方教育評(píng)估機(jī)構(gòu)的人才培養(yǎng)質(zhì)量年度報(bào)告，評(píng)估學(xué)生的職業(yè)能力與素質(zhì)并及時(shí)反饋，確保人才培養(yǎng)質(zhì)量的全面提高。

3 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)利用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap-MS/MS 聯(lián)用技術(shù)分析生物樣品，基于不同基質(zhì)樣品在負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜提供的分子離子和碎片離子等精確信息（圖2-圖3），鑒定異綠原酸C在大鼠血漿、尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物。根據(jù)原型化合物的裂解規(guī)律、相對(duì)保留時(shí)間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及結(jié)合文獻(xiàn)來推測(cè)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，在血漿、尿液、糞便中共檢測(cè)到包括原型在內(nèi)的11 個(gè)成分，其中糞便（F）中發(fā)現(xiàn)原型（M0）外，還有4個(gè)代謝物（M1-M4）；尿液（U）中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)代謝物（M5-M10）；在血漿中未發(fā)現(xiàn)代謝物，詳細(xì)信息見表1。其代謝途徑包括有水解、氧化、還原、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化。

在負(fù)離子模式下，檢測(cè)到M0 準(zhǔn)分子離子峰m/z515.121 0([M-H]-，C25H23O12)，其相對(duì)保留時(shí)間為19.66 min。分子離子碎裂，產(chǎn)生m/z353.088 5 (C16H17O9)、191.055 7 (C7H11O6)、179. 034 6 (caffeoyl，C9H7O4)、173.054 0(C7H9O5)、135.044 2(C8H7O2)碎片離子。其中m/z353.088 5 是異綠原酸C 脫去1 分子咖啡?；玫降乃槠琺/z191.056 1 是異綠原酸C 脫去兩分子咖啡酰形成的奎寧酸負(fù)離子碎片，m/z179.034 6 是咖啡?；奶卣魉槠槠x子m/z135.045 5 是咖啡?；? 分子CO2所得。綜合保留時(shí)間以及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信息，確定化合物M0為異綠原酸C。

表1 異綠原酸C在大鼠糞便和尿液中的代謝產(chǎn)物匯總信息

圖2 空白和給藥大鼠糞便樣品在負(fù)離子模式下的色譜圖

圖3 空白和給藥大鼠尿液樣品在負(fù)離子模式下的色譜圖

3.1 大鼠糞便中的代謝產(chǎn)物

3.1.1 原型藥物M0質(zhì)譜裂解途徑推斷

在21世紀(jì)的互聯(lián)網(wǎng)和人工智能新時(shí)代中，有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)力的出版物不少，而《論領(lǐng)導(dǎo)力》一書是領(lǐng)導(dǎo)力學(xué)術(shù)界的一朵奇葩，讀此書的人對(duì)其評(píng)價(jià)是“喜歡其中的思想和醍醐灌頂?shù)慕鹁洹薄?/p>

“咬碎了牙齒怎么了呢？咬碎了牙齒和血吐?！霞揖陀羞@句話?！彼f，“不管怎么說，我總算是憑自己的力量在風(fēng)城買了房子啊?！?/p>

3.1.2 代謝產(chǎn)物M1結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M1 的tR為6.59 min，[M-H]-為m/z221.067 5（C8H13O7），產(chǎn)生m/z203.106 5、159.044 6、141.000 7、137.096 7 碎片離子。其中離子m/z221.067 5比奎寧酸（m/z191.056 1）多30 Da，推測(cè)其為C7H11O6+O+CH2，而二級(jí)碎片離子m/z203. 106 5比m/z221.067 5 少18 Da ,推測(cè)其為m/z221.067 5 失去1 分子H2O 產(chǎn)生的裂片。推測(cè)M1 代謝途徑為水解反應(yīng)、單氧化反應(yīng)、甲基化反應(yīng)。

Thermo C18色譜柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0-2 min，3% A；2-24 min，3%→25% A；24-25 min，25%→95% A；25-27 min，95% A；27-27.1 min，95%→3%A；27.1-30 min，3% A）。進(jìn)樣室溫度設(shè)置為10℃；柱溫為40℃；流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積為5 μL。

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M7 的tR為7.39 min，[M-H]-為m/z355.104 7（C16H19O9），得到m/z179.070 9、113.023 6 的碎片離子。其中m/z355.104 7 為異綠原酸C 脫去一個(gè)咖啡?；l(fā)生氫化還原反應(yīng)的信號(hào)，m/z179.070 9 是咖啡?；谪?fù)離子模式的特征信號(hào)，推測(cè)M7的代謝途徑為水解反應(yīng)、氫化反應(yīng)。

3.1.4 代謝產(chǎn)物M3結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

除了不喜歡人們潑水、扔石子，以及用竿子捅戳以外，明尼對(duì)人類并沒有真正的惡感。但此刻它的眼中滿是寒光，滿腔冰冷的恨意全集中在了眼前這個(gè)男人身上。這是從古老濕地的深處挖掘出來的、久被遺忘的來自爬行動(dòng)物的恨意，這股恨意匯聚成了鋒利的目光。將漁線緊拉在船舷上的男人感受到了這道目光古怪的力量，心里有點(diǎn)發(fā)毛。這雙充滿敵意的眼睛正一眨不眨地死死地盯著他！

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M3 的tR為11.30 min，[M-H]-為m/z367.101 7（C17H19O9），產(chǎn)生m/z193.0502、178.062 3、134.063 6 碎片離子。其中m/z367.101 7 比m/z353.087 8 多14 Da，推測(cè)其為m/z353.087 8 發(fā)生甲基化反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)，m/z193.050 2 為咖啡酰甲基化產(chǎn)生的信號(hào)（C10H9O4），推測(cè)M3為異綠原酸C水解脫去一個(gè)咖啡?；瑫r(shí)發(fā)生甲基化反應(yīng)的產(chǎn)物，其代謝途徑為水解反應(yīng)、甲基化反應(yīng)。

3.1.5 代謝產(chǎn)物M4結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

體驗(yàn)式教學(xué)法，是指在教學(xué)過程中為了達(dá)到既定的教學(xué)目的，從教學(xué)需要出發(fā)，引入、創(chuàng)造或創(chuàng)設(shè)與教學(xué)內(nèi)容相適應(yīng)的具體情境或氛圍，以引起學(xué)生的情感體驗(yàn)，幫助學(xué)生迅速而正確地理解教學(xué)內(nèi)容，促進(jìn)他們心理機(jī)能全面和諧發(fā)展的一種教學(xué)方法。體驗(yàn)式教學(xué)法使學(xué)生身臨其境或如臨其境，一則帶給學(xué)生從形象的感知到抽象的理性的頓悟，二則激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)情緒，使學(xué)習(xí)活動(dòng)成為自主自發(fā)的活動(dòng)。同時(shí)，在教學(xué)實(shí)踐中，體驗(yàn)式教學(xué)法在英語(yǔ)閱讀課、寫作課研究相對(duì)較多，而將其運(yùn)用到語(yǔ)法課研究的則比較少。[1]

五要著力搞好協(xié)調(diào)配合。水利財(cái)務(wù)工作涉及水利各個(gè)領(lǐng)域，貫穿各個(gè)環(huán)節(jié)，必須加強(qiáng)協(xié)調(diào)，形成合力。要建立與各有關(guān)部門的溝通協(xié)調(diào)機(jī)制，形成相互理解、相互支持的工作氛圍，爭(zhēng)取更多有利于水利改革發(fā)展的政策措施。要加強(qiáng)內(nèi)部上下級(jí)之間和部門之間的溝通配合，建立工作信息通報(bào)和反饋機(jī)制，密切配合，良性互動(dòng)，切實(shí)提高工作水平。

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M4 的tR為14.78 min，[M-H]-為m/z367.104 6（C17H19O7），產(chǎn)生m/z193.050 3、173.044 9、93.033 5 碎片離子。其中m/z367.104 6 為m/z353.087 8 發(fā)生甲基化反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)，m/z193.050 3 為咖啡酰甲基化產(chǎn)生的信號(hào)（C10H9O4）；m/z173.044 9 為m/z191.056 1（C7H11O6）脫去一分子H2O 產(chǎn)生的信號(hào)，推測(cè)M4為異綠原酸C水解脫去一個(gè)咖啡?；瑫r(shí)發(fā)生甲基化反應(yīng)的產(chǎn)物，其代謝途徑為水解反應(yīng)、甲基化反應(yīng)。

水利工程的建設(shè)，積極推進(jìn)全面質(zhì)量管理，采用先進(jìn)的質(zhì)量管理模式和管理手段，科學(xué)技術(shù)和先進(jìn)的施工技術(shù)的推廣，利用科學(xué)的方法和科技的力量降低工程的材料成本，提高工程質(zhì)量。施工企業(yè)要實(shí)施全面質(zhì)量管理，建立健全質(zhì)量保證體系，制定和完善崗位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量責(zé)任和考核辦法，實(shí)施質(zhì)量責(zé)任制。在施工過程中加強(qiáng)質(zhì)量檢查工作，認(rèn)真落實(shí)“三項(xiàng)制度”，全過程的控制，對(duì)項(xiàng)目的質(zhì)量，關(guān)系到企業(yè)的前途和命運(yùn)，是水利水電施工企業(yè)基于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)抓住關(guān)鍵。

3.2 大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物

3.2.1 代謝產(chǎn)物M5結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M5 的tR為8.47 min，[M-H]-為m/z237.061 9（C8H13O8），產(chǎn)生m/z195.113 7、165.057 6（C9H10O3）、149.096 5、121.048 2 的碎片離子，推測(cè)M5 的代謝途徑為水解反應(yīng)、雙氧化反應(yīng)、甲基化反應(yīng)。

3.2.2 代謝產(chǎn)物M6結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占人體皮膚蛋白質(zhì)的70%。在真皮層中，膠原蛋白與其他物質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有助于皮膚穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度、彈性。目前關(guān)于口服膠原蛋白肽改善皮膚的研究很多，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服膠原蛋白肽具有改善皮膚狀況、減少皺紋、提高皮膚水分、修復(fù)光損傷皮膚、延緩衰老等功能[2]。其機(jī)理主要是攝入膠原蛋白肽后，能夠提高皮膚中膠原蛋白表達(dá)，降低基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性[3]，以特異性蛋白的方式影響成纖維細(xì)胞的增殖和膠原纖維的形成[4]。

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M6 的tR為6.26 min，[M-H]-為m/z271.011 6（C7H11O9S），產(chǎn)生m/z191.054 2、161.034 7、96.958 9的碎片離子。其中m/z191.054 2（C7H11O6）為m/z271.011 1脫去一分子SO3，即奎寧酸的特征信號(hào)；m/z161.034 7為咖啡?；奶卣魉槠?，即咖啡酸（C9H7O4）脫去一分子H2O 產(chǎn)生的信號(hào)，推測(cè)M6 的代謝途徑為水解反應(yīng)、硫酸酯化反應(yīng)。

3.2.3 代謝產(chǎn)物M7結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M2 的tR為3.60 min，[M-H]-為m/z237.060 8（C8H13O8），產(chǎn)生m/z193.069 6、137.043 5 的碎片離子。其中離子m/z237.060 8 比奎寧酸（m/z191. 056 1）多46 Da，推測(cè)其為C7H11O6+2O+CH2，推測(cè)M2 的代謝途徑為水解反應(yīng)、雙氧化反應(yīng)、甲基化反應(yīng)。

3.2.4 代謝產(chǎn)物M8結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M8 的tR為13.81 min，[M-H]-為m/z355.103 1（C16H19O9），產(chǎn)生m/z179.070 9、113.023 6 的碎片離子。其中m/z355.103 1 為異綠原酸C 酸脫去一個(gè)咖啡?；l(fā)生氫化還原反應(yīng)的信號(hào)，m/z179.070 9（C9H7O4）是咖啡?；谪?fù)離子模式的特征信號(hào)，推測(cè)M8 的代謝途徑為水解反應(yīng)、氫化反應(yīng)。

(3)凈化過濾機(jī)。本項(xiàng)目通過消化、吸收、再創(chuàng)新，解決了通常管式過濾器鋼襯膠骨架橡膠層彈性收縮易開裂等腐蝕問題，使得骨架壽命由半年左右延長(zhǎng)至5年多，管式過濾器運(yùn)行狀況良好，綜合性能指標(biāo)大幅提升。其他類型過濾機(jī)各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)良好，運(yùn)行正常。

3.2.5 代謝產(chǎn)物M9結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

（1）假設(shè)數(shù)據(jù)集的維數(shù)為d，SU={u1，u2，…，u2d}為沒有鄰近稠密網(wǎng)格的稀疏網(wǎng)格單元，計(jì)算各網(wǎng)格的重心點(diǎn)坐標(biāo) gi|i=1，2，…，2d；

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M9 的tR為3.87 min，[M-H]-為m/z435.061 6（C16H19O12S），產(chǎn)生m/z355.105 7、191.055 3、173.045 3、113.023 4、96.956 0 碎片離子。其中m/z435.061 6 為m/z353.087 8+2H+SO3產(chǎn)生的信號(hào)，m/z355.105 7 為m/z435.061 6 脫去一分子SO3產(chǎn)生的信號(hào)，m/z191.055 3（C7H11O6）是奎寧酸在負(fù)離子模式的特征信號(hào)，m/z173.045 3 為奎寧酸脫去一分子H2O 產(chǎn)生的信號(hào)，推測(cè)M9 的代謝途徑為水解反應(yīng)、氫化反應(yīng)、硫酸酯化反應(yīng)。

3.2.6 代謝產(chǎn)物M10結(jié)構(gòu)及代謝途徑推斷

在負(fù)離子模式下，代謝產(chǎn)物M10 的tR為7.75 min，[M-H]-為m/z529.120 4（C22H25O15），產(chǎn)生m/z353.088 6、179.034 7、135.043 8 碎片離子。其中m/z529.120 4 為m/z353.088 6 與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)，m/z353.088 6（C16H17O9）為異綠原酸C 脫去一個(gè)咖啡?；a(chǎn)生的信號(hào)，m/z179.034 7（C9H7O4）是咖啡?；谪?fù)離子模式的特征信號(hào)，m/z135.043 8 為咖啡酰基脫去一分子CO2產(chǎn)生的信號(hào)，推測(cè)M10 為異綠原酸C 水解脫去一個(gè)咖啡?；⑴c葡萄糖醛酸結(jié)合生成的產(chǎn)物，其代謝途徑為水解反應(yīng)、葡萄糖醛酸化反應(yīng)。

3.3 異綠原酸C大鼠體內(nèi)的代謝途徑分析

異綠原酸C經(jīng)灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的代謝途徑主要有水解、甲基化、氧化、還原、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等（圖4）。異綠原酸C（C25H24O12，m/z515.121 0）進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，首先水解脫去一個(gè)咖啡?；纬蓡慰Х弱；鼘幩幔╩/z353.087 8，C16H18O9），該中間體可以發(fā)生甲基化反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M3 和M4（m/z367.101 7,C17H19O9）、氫化還原形成代謝產(chǎn)物M7 和M8（m/z355.103 5,C16H20O9）、氫化和硫酸酯化反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M9（m/z435.061 6, C16H19O12S）、葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物M10（m/z529.120 4,C22H25O15）。此外，異綠原酸C 進(jìn)入大鼠體內(nèi)后也可水解脫去二個(gè)咖啡?；纬煽鼘幩嶂虚g體（m/z191.055 7,C7H11O6），該中間體可以發(fā)生單氧化和甲基化反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M1（m/z221.067 5,C8H13O7）、雙氧化和甲基化反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M2 和M5（m/z237.060 8,C8H13O8）、硫酸酯化反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M6（m/z271.011 6,C7H11O9S）。

圖4 異綠原酸C大鼠體內(nèi)代謝途徑推測(cè)

4 討論與結(jié)論

生物樣品組成比較復(fù)雜，尤其蛋白質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響分離效果以及待測(cè)物的離子化效率。因此生物樣品的預(yù)處理在樣品分析過程中極為重要[22-23]。測(cè)定血漿樣品前，需去除蛋白質(zhì)，預(yù)防發(fā)生乳化，影響質(zhì)譜儀器的信號(hào)響應(yīng)，延長(zhǎng)其使用壽命。LC-MS 技術(shù)兼具有色譜和波譜兩者優(yōu)勢(shì)，分離度好、適用范圍廣、靈敏度高、分析時(shí)間短，可從大量混合物中分離出單一成分進(jìn)而獲得單一成分的質(zhì)譜信息，且樣品不需要進(jìn)行衍生化處理，依靠高分辨質(zhì)譜給出的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜的精確數(shù)據(jù)，推斷化合物結(jié)構(gòu)。高分辨率質(zhì)譜具有分離度好、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬的特點(diǎn)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥物代謝產(chǎn)物鑒定應(yīng)用方面發(fā)揮了重大作用[24-26]。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 技術(shù)檢測(cè)異綠原酸C 在大鼠血漿、糞便、尿液中的代謝物，然后利用Thermo Xcalibur Qual Browser 軟件分析色譜峰，確證代謝產(chǎn)物。大鼠經(jīng)灌胃給藥后，異綠原酸C經(jīng)小腸吸收入血后隨血液循環(huán)分布到機(jī)體的各個(gè)器官發(fā)揮治療作用。此外，藥物的首過效應(yīng)、溶解性、溶出度及生理因素等也會(huì)影響藥物在體內(nèi)的吸收[27]。中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定是中藥代謝研究的基礎(chǔ)部分，不僅能為臨床安全用藥提供參考，還可用于指導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)修飾，為新的藥物分子設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

根據(jù)異綠原酸C 具有多個(gè)酚羥基、酯鍵和羧基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和詹美榕等[19]研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的代謝產(chǎn)物表明異綠原酸C 在體內(nèi)能發(fā)生酯鍵水解、有甲基化反應(yīng)、水合反應(yīng)、去水合反應(yīng)、還原反應(yīng)、葡萄糖醛酸化反應(yīng)、硫酸酯化反應(yīng)等。詹美榕等研究在大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)多個(gè)代謝產(chǎn)物，但在本實(shí)驗(yàn)測(cè)定中未發(fā)現(xiàn)血漿代謝產(chǎn)物，究其原因我們實(shí)驗(yàn)選擇單次給藥（給藥劑量20 mg·kg-1），而文獻(xiàn)報(bào)道[19]采用連續(xù)7 天灌胃給予藥物（給藥劑量20 mg·kg-1，每天1 次），連續(xù)給藥也許導(dǎo)致大鼠體內(nèi)代謝酶發(fā)生改變，并且會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的富集從而導(dǎo)致血漿中代謝產(chǎn)物的不同。本實(shí)驗(yàn)開展大鼠血漿、尿液、糞便代謝產(chǎn)物的鑒定，可以更全面地了解不同生物基質(zhì)中異綠原酸C 的可能代謝產(chǎn)物，后期還可以采用大鼠膽管插管模型（BDC）進(jìn)行研究，探討其膽汁排泄產(chǎn)物。