王婧文 ， 譚貽鴻 ， 高昊天 ， 張東林 ， 史秋梅 ， 高桂生 ， 高光平

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院 ， 河北 廊坊 065001)

五味子是傳統(tǒng)中藥，屬于木蘭科植物，在我國(guó)有豐富的資源，盛產(chǎn)于中國(guó)北方地區(qū)特別是東北三省[1]。按照產(chǎn)地不同分為南五味子和北五味子，二者相比，北五味子品質(zhì)更好，且保存時(shí)間長(zhǎng)不易霉變[2]。五味子滋補(bǔ)能力強(qiáng)，具有護(hù)肝、降糖、降血脂和補(bǔ)腎的功效。研究發(fā)現(xiàn)，含有五味子乙素為代表的木脂素類物質(zhì)，具有抑制細(xì)菌增殖、抗氧化、抗病毒等作用 ； 從五味子仁中提取的五仁醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的抑制作用，在臨床可用于慢性鎮(zhèn)痛[3]。中獸醫(yī)對(duì)五味子的使用由來(lái)已久，近年來(lái)對(duì)其有效成分及作用機(jī)理的研究不斷深入。研究證實(shí)，五味子中含有的有機(jī)酸和揮發(fā)油成分具有鎮(zhèn)咳作用，含有的木脂素類成分不僅可以發(fā)揮抑菌作用，還能保護(hù)機(jī)體心肌結(jié)構(gòu)、鎮(zhèn)痛和保肝，此外，含有的多糖類物質(zhì)可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤和抗氧化[4]。因此，五味子用于動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中可發(fā)揮提高免疫力等多種作用。

貉大腸桿菌病是養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)病，主要是由大腸桿菌引起的，大腸桿菌是條件致病菌，常存在于貉腸道內(nèi)，一旦飼養(yǎng)環(huán)境改變，貉抵抗力下降，就會(huì)使大腸桿菌大量繁殖，轉(zhuǎn)移至其他器官，引起貉消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致貉死亡[5]。幼貉患大腸桿菌病主要癥狀是水樣腹瀉，成年貉還可能出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎的現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)敗血癥癥狀[6]，導(dǎo)致毛皮質(zhì)量下降，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通常養(yǎng)殖戶使用抗菌藥來(lái)治療貉大腸桿菌病，但由于抗菌藥的濫用，大腸桿菌的耐藥性提高，普通抗菌藥難以發(fā)揮作用，給治療帶來(lái)困難。五味子作為抑菌效果強(qiáng)的中藥，逐漸替代抗菌藥，但其煎劑濃度對(duì)貉源大腸桿菌的增殖能力以及對(duì)耐藥性的消除效果并不明確。本試驗(yàn)將設(shè)立五味子煎劑濃度梯度，通過(guò)比較不同濃度下貉源大腸桿菌增殖和耐藥基因缺失的程度，探究濃度對(duì)細(xì)菌增殖和耐藥性的影響，以期為五味子的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試菌株為河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存的貉耐藥性菌株，菌株編號(hào)為L(zhǎng)40。五味子，購(gòu)自秦皇島民樂(lè)藥店有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 DL2 000 Marker和2×TaqPCR Master Mix，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純)，購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。DXY-33A型電泳儀，由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)；AglentsureCycler880 PCR儀，由美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)；ChemiDocTMXRS+ 凝膠成像系統(tǒng)，由美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)；其他試劑和儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 中藥液的制備 稱取已粉碎的五味子40 g，過(guò)篩后置于燒杯中，加入蒸餾水200 mL，然后靜置1 h，加熱煮沸，不斷攪拌，沸騰后改用文火煮30 min，煎煮完成后用4層紗布過(guò)濾；取藥渣加入100 mL蒸餾水，重復(fù)上述操作；將2次得到的藥液合并，去除藥渣后用文火濃縮至40 mL，五味子煎劑濃度為1 g/mL；室溫靜置24 h后離心，將得到的上清液pH調(diào)整為7.3左右，然后高壓滅菌，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

1.4 菌懸液的制備 將貉源大腸桿菌從冰箱中取出，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上復(fù)蘇、活化；將活化后的貉源大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)18 h后，挑取單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)，用無(wú)菌PBS將菌液稀釋至終濃度為1×107CFU/mL。菌液置于4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.5 不同濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌增殖的影響 五味子煎劑濃度為1 000.00 mg/mL，用LB培養(yǎng)液進(jìn)行2倍倍比稀釋，獲得的10個(gè)梯度濃度分別是500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL和0.98 mg/mL。分別吸取上述各濃度的五味子煎劑4 mL，加入1.4中配制好的菌懸液200 μL，37 ℃下靜置培養(yǎng)，接種完成記為0 h，每隔4 h吸取菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[9]。同時(shí)，在4 mL LB培養(yǎng)液加入200 μL菌懸液，作為陰性對(duì)照；設(shè)置SDS濃度分別為0.120%、0.060%、0.030%、0.015%、0.008%，0.150%、0.075%、0.038%、0.019%和0.009%，在4 mL不同濃度的SDS溶液中加入200 μL菌懸液，作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 不同濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌耐藥性的影響 將經(jīng)1.5處理的貉源大腸桿菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，接種于LB培養(yǎng)液中，增菌后檢測(cè)耐藥基因。

1.6.1 耐藥基因引物 檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blaTEM1、blaPSE1、blaOXA1、blaTEM、blaSHV-1和blaCTX-M，氨基糖苷類耐藥基因aadA1和strA-strB，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC和tetD，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB、ermC和ermF，以及磺胺類耐藥基因sul1、sul2和sul3，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)耐藥基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6.2 耐藥基因PCR檢測(cè) 采用熱裂解法制備貉源大腸桿菌DNA，首先將待測(cè)菌株劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落加入200 μL滅菌超純水中，充分混勻，制成菌懸液，100 ℃煮沸10 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

將制備的貉源大腸桿菌DNA置于室溫融化，以其作為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，超純水補(bǔ)至20 μL。四環(huán)素類耐藥基因PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。氨基糖苷類耐藥基因PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；92 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min?；前奉惸退幓騊CR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；92 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.7 五味子煎劑作用前后貉源大腸桿菌對(duì)抗菌藥敏感性的變化 在普通瓊脂培養(yǎng)基上分別滴加未經(jīng)處理的懸菌液和經(jīng)1.5處理后的菌懸液10 μL，用三角形玻璃棒涂勻，采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，抑菌圈直徑在13 mm以下表明貉源大腸桿菌對(duì)該藥物有耐藥性；抑菌圈直徑在13～18 mm為中度敏感；抑菌圈直徑大于18 mm為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌增殖的影響 由表1可知，與陰性對(duì)照相比，15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌的增殖有明顯的抑制作用，且隨著五味子煎劑濃度增加，菌株增殖數(shù)量逐漸減少；經(jīng)62.50～500.00 mg/mL五味子煎劑作用12 h后無(wú)貉源大腸桿菌增殖。結(jié)果表明，15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌增殖存在抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。

表1 不同濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌分離株體外增殖的影響Table 1 Proliferation of E.coli strain in vitro after treatment with different concentrations of Schisandra decoction (CFU/mL)

2.2 不同濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌攜帶耐藥基因的影響 貉源大腸桿菌在五味子煎劑作用前共檢出12種耐藥基因。由于經(jīng)62.50～500.00 mg/mL的五味子煎劑作用后貉源大腸桿菌已死亡，因此未檢測(cè)耐藥基因，經(jīng)0.98～31.25 mg/mL五味子煎劑作用后菌株的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，31.25 mg/mL五味子煎劑作用后菌株的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由表2可知，與陰性對(duì)照相比，五味子煎劑作用后菌株攜帶的耐藥基因數(shù)量明顯減少，0.98～3.91 mg/mL五味子煎劑對(duì)消除菌株耐藥基因的作用較弱，均消除了6種耐藥基因；結(jié)合圖1可知，31.25 mg/mL五味子煎劑消除貉源大腸桿菌的耐藥基因數(shù)量較多，消除了9種耐藥基因。結(jié)果表明，五味子煎劑消除貉源大腸桿菌耐藥基因的效果隨濃度升高而增強(qiáng)。

表2 貉源大腸桿菌分離株經(jīng)不同濃度的五味子煎劑作用后耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different concentrations of Schisandra decoction

圖1 貉源大腸桿菌分離株經(jīng)不同藥物作用后耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different drugsA：陰性對(duì)照; B：五味子煎劑濃度為31.25 mg/mL； C：SDS濃度為0.120%A:Negative control; B:Schisandra decoction concentration was 31.25 mg/mL; C:SDS concentration was 0.120%M:DL2 000 DNA Marker; 1:tetA; 2:tetB; 3:tetC; 4:tetD; 5:ermB; 6:ermC; 7:ermF; 8:blaTEM; 9:blaTEM1; 10:blaCTX-M; 11:blaPSE1; 12:blaOXA1; 13:blaSHV-1; 14:aadA1; 15:strA-strB; 16:sul1; 17:sul2; 18:sul3

2.3 五味子煎劑作用前后貉源大腸桿菌對(duì)抗菌藥敏感性的變化 貉源大腸桿菌經(jīng)五味子煎劑作用前后對(duì)12種常用抗菌藥的藥物敏感結(jié)果見(jiàn)表3。五味子煎劑作用前菌株對(duì)6種抗菌藥耐藥，經(jīng)五味子煎劑作用后菌株對(duì)3種抗菌藥耐藥。結(jié)果表明，經(jīng)五味子煎劑作用后，貉源大腸桿菌對(duì)抗菌藥的敏感性增加。

表3 貉源大腸桿菌經(jīng)五味子煎劑作用前后藥物敏感性的變化Table 3 Changes of drug resistance of multidrug resistant E.coli before and after treatment with Schisandra decoction

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)，五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌有明顯的抑菌作用，且隨著濃度增加，其抑制貉源大腸桿菌的增殖和消除耐藥基因效果增強(qiáng)，并能夠提高貉源大腸桿菌對(duì)抗菌藥的敏感性。本試驗(yàn)可以看出，五味子煎劑可以降低貉源大腸桿菌的菌落數(shù)量，與李蘊(yùn)玉等[11]結(jié)果一致。但五味子抑制細(xì)菌增殖的作用機(jī)理并不明確，有待進(jìn)一步研究，目前普遍認(rèn)為五味子中含有的多烯類化合物可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)流出，阻礙細(xì)菌的正常代謝，從而降低細(xì)菌增殖速度[3]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，31.25 mg/mL的五味子煎劑消除貉源大腸桿菌攜帶的耐藥基因較多，而且可提高貉源大腸桿菌對(duì)抗菌藥的敏感性，但與其他的研究人員報(bào)道五味子降低耐藥性效果差異較大，據(jù)李棟[12]研究證實(shí)，五味子可消除禽源大腸桿菌的耐藥基因，消除率可達(dá)96%，造成不同結(jié)果的原因可能為以下三方面：一是不同地區(qū)購(gòu)買的中藥品質(zhì)不同；二是研究的大腸桿菌動(dòng)物來(lái)源不同；三是對(duì)中藥有效成分提取方法和具體操作步驟不盡相同，從而導(dǎo)致中藥液中有效成分有一定的差異，作用效果就會(huì)存在差異。目前對(duì)五味子的耐藥基因消除作用的研究較少，張媛媛[3]研究認(rèn)為，五味子能降低細(xì)菌的耐藥性是通過(guò)消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)的，五味子對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)菌的耐藥菌株均有明顯的抑制作用，其可不同程度地消除多重耐藥菌株的體外R質(zhì)粒。

本試驗(yàn)結(jié)果證明，五味子煎劑可以用來(lái)治療貉大腸桿菌病。貉大腸桿菌病是阻礙貉養(yǎng)殖業(yè)良性發(fā)展的人獸共患病，近幾年，由于抗菌藥的濫用，大腸桿菌的耐藥性逐年提高，給貉大腸桿菌病的預(yù)防和治療帶來(lái)了極大的困難。有研究發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)50年代時(shí)大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥都高度敏感，但20世紀(jì)80年代末90年代初時(shí)大腸桿菌對(duì)11種抗菌藥已產(chǎn)生了耐藥性[13]。養(yǎng)殖戶對(duì)抗菌藥的不合理應(yīng)用也加速了大腸桿菌耐藥性的發(fā)展，出現(xiàn)了愈來(lái)愈多的多重耐藥性大腸桿菌，多重耐藥性菌株已成為養(yǎng)殖過(guò)程中的巨大難題，使得藥效下降，用藥劑量不斷攀升，不僅增加了養(yǎng)殖成本，而且不能有效控制病情發(fā)展以及預(yù)防疾病的發(fā)生，阻礙了毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)步。五味子煎劑在臨床上應(yīng)用不僅可以治療貉大腸桿菌病，還可消除貉源大腸桿菌的耐藥基因，為解決貉源大腸桿菌耐藥性增加的問(wèn)題提供了新思路。

目前為止，有關(guān)中藥作為耐藥性消除劑的作用機(jī)理研究較少，且均不夠深入，本試驗(yàn)雖然證實(shí)了15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對(duì)貉源大腸桿菌體外增殖和耐藥性有明顯的作用效果，但是其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)證實(shí)了五味子煎劑的抑菌作用與其濃度成正比，因此在臨床實(shí)踐中可根據(jù)貉的體重適當(dāng)調(diào)高五味子煎劑的濃度用于治療貉大腸桿菌病。