周丹丹，李婷婷，吳彩娥，屠 康

（1.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

水蜜桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，采收多集中于高溫高濕的夏季，常溫貯藏過程中受病菌侵染易腐敗變質(zhì)，造成品質(zhì)嚴(yán)重劣變。桃果實(shí)采后極不耐貯，嚴(yán)重限制了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。低溫有利于延緩桃果實(shí)后熟過程，但桃屬于冷敏型果實(shí)，低溫貯藏易發(fā)生冷害，從而引起一系列生理生化和品質(zhì)變化，如果實(shí)風(fēng)味變淡、可溶性糖和有機(jī)酸含量下降、果肉木質(zhì)化、組織發(fā)生褐變等，影響了果實(shí)的正常后熟。采后處理技術(shù)等外界因素對果實(shí)品質(zhì)具有重要影響，因此，研究釆后保鮮技術(shù)對桃果實(shí)生理代謝的影響具有重要意義。

熱空氣（hot air，HA）處理指將樣品置于35～50 ℃環(huán)境中進(jìn)行短時(shí)處理，目前已廣泛應(yīng)用于果蔬的采后貯藏保鮮中。HA處理可以有效延緩果實(shí)的成熟衰老，抑制果實(shí)的腐敗變質(zhì)，提高果實(shí)的抗冷性，延長果實(shí)的貨架期。研究表明，HA處理可以通過增強(qiáng)熱激蛋白的表達(dá)量協(xié)同提高果實(shí)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，從而提高果實(shí)的抗冷害能力。同時(shí)，HA處理能夠誘導(dǎo)果實(shí)次級代謝物的合成和抗氧化酶的活性，激活植物組織的抗病性，從而提高果蔬的抗病能力。

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究可以鑒定基因/蛋白的功能、探索基因/蛋白的調(diào)控過程、鑒定差異基因/蛋白，為探索果實(shí)采后生理變化的機(jī)理提供有利的工具，目前已在番茄、桃、葡萄、黃皮、石榴和馬鈴薯等果蔬中廣泛應(yīng)用。考慮到HA處理激發(fā)桃果實(shí)多條代謝途徑的復(fù)雜性，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究HA處理對桃果實(shí)采后糖酸和酚類物質(zhì)代謝的影響，以期從基因水平和蛋白水平揭示HA處理對桃果實(shí)采后冷藏過程中的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘霞暉8號’水蜜桃采自江蘇省農(nóng)科園，選取開花后110 d左右的商業(yè)成熟期桃果實(shí)于當(dāng)天采收立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選大小一致，著色均勻，成熟度一致且無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)對象（720 個(gè)果實(shí)），于4 ℃環(huán)境下預(yù)冷過夜。

葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸、蘋果酸（標(biāo)品）上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CTHI-250B恒溫恒濕箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；BGISEQ-500通用測序儀 深圳華大基因股份有限公司；ABI 7500型定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核酸擴(kuò)增儀 美國Applied Biosystems公司；LC 20AB高效液相色譜 日本島津公司；UltiMate 3000超高效液相色譜、Q Exactive HF X串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果實(shí)分組與處理

熱空氣（HA）組：將桃果實(shí)置于聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮袋中后于40 ℃、相對濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中處理4 h。

對照（CK）組：將桃果實(shí)置于PE保鮮袋中后于20 ℃，相對濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中處理4 h。

將上述處理后的桃果實(shí)于（1±1）℃冷庫中貯藏35 d，每隔7 d取樣進(jìn)行指標(biāo)（可溶性糖、有機(jī)酸、總酚、總黃酮、花色苷含量）測定。實(shí)驗(yàn)每組處理設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平行包含20 個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。將貯藏至第0、7、21、35天的樣品用于轉(zhuǎn)錄組分析，將貯藏至第0、7、35天的樣品用于蛋白質(zhì)組分析。

1.3.2 可溶性糖和有機(jī)酸含量測定

桃果實(shí)糖酸含量的測定參考Yu Lina和Tang Mi等的方法并稍作修改。取5 g桃果肉樣品充分研磨，加入30 mL蒸餾水充分溶解，在80 ℃的水浴鍋中采用超聲波提取1 h。將上述樣品8 000×離心10 min后取上清液并用0.45 μm水系濾膜過濾備用。

可溶性糖含量測定：色譜柱為碳水化合物柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)75%乙腈溶液，流速為1 mL/min，采用配有蒸發(fā)光散射檢測器檢測。

有機(jī)酸含量測定：色譜柱為Atlantis T3柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀（20 mmol/L，pH 2.5），流速為0.6 mL/min。根據(jù)光電二極管陣列檢測器的掃描模式，在210 nm波長處對果實(shí)有機(jī)酸組分進(jìn)行檢測。

通過與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較，對糖和有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量，每種化合物含量的單位為mg/g。樣品測定設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3 次平行測定。

1.3.3 總酚和總黃酮含量測定

總酚含量測定采用福林-酚法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮含量采用NaNO-Al(NO)-NaOH比色法測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。總酚含量和總黃酮含量單位為mg/g。樣品測定設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置3 次平行測定。

1.3.4 花色苷含量測定

桃果實(shí)總花色苷含量的采用pH值示差法進(jìn)行測定，花色苷含量單位為μg/g。樣品測定設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置3 次平行測定。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序檢測

1.3.5.1 總RNA的提取與cDNA建庫

采用植物總RNA提取試劑盒提取桃RNA，經(jīng)過凝膠電泳和Nanodrop超微量分光光度計(jì)測定吸光度以檢測RNA的完整性和濃度，檢測合格的RNA由華大基因通過BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行測序，構(gòu)建cDNA文庫。每個(gè)取樣點(diǎn)樣品分別設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.5.2 測序數(shù)據(jù)過濾和比對

使用過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，過濾去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads。得到clean reads后將其比對到參考基因組序列（NCBI_Prunus_persica_NCBIv2），之后再使用FPKM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。

1.3.5.3 差異表達(dá)基因的鑒定

基因表達(dá)量采用FPKM值表示，顯著差異表達(dá)基因的篩選條件為差異倍數(shù)兩倍以上（即|logFC|＞1）并且≤0.001。

1.3.5.4 差異表達(dá)基因的GO分析和京都基因與基因組百科全書分析

使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析，計(jì)算值，然后進(jìn)行錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正，通?！?.05的功能視為顯著富集。根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）注釋結(jié)果及官方分類，將差異基因進(jìn)行功能分類。根據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進(jìn)行生物通路分類。

1.3.5.5 差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析

隨機(jī)選取9 個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析，利用NCBI數(shù)據(jù)庫查找桃果實(shí)相關(guān)基因的CDS序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），qPCR采用AceQqPCR SYBRGreen Master Mix試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)，采用兩步法反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析以作為內(nèi)參基因，采用2法進(jìn)行基因相對定量計(jì)算。每組處理重復(fù)3 次。

表1 qPCR引物設(shè)計(jì)列表Table 1 Primers used for real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis

1.3.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.6.1 蛋白質(zhì)的提取與酶解分離

桃果肉加入2 mL Lysis Buffer 3（含1 mmol/L的苯甲磺酰氟和2 mmol/L的乙二胺四乙酸），渦旋振蕩后靜置5 min，添加0.5 mL 10 mmol/L的二硫蘇糖醇后振蕩2 min。樣品25 000×離心20 min，取上清液加入0.5 mL 10 mmol/L二硫蘇糖醇，56 ℃水浴1 h后加入0.2 mL 55 mmol/L碘乙酰胺暗室靜置45 min。加入4 倍體積冷丙酮，-20 ℃靜置2 h，樣品25 000×離心20 min，向沉淀中加入適量的Lysis Buffer 3，然后超聲處理使沉淀溶解后25 000×離心20 min，取上清液，進(jìn)行蛋白濃度定量。利用Bradford法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。將符合質(zhì)量要求的蛋白質(zhì)采用胰蛋白酶酶解，將酶解后的肽段利用Strata X柱進(jìn)行除鹽后取樣品進(jìn)行分離，采用LC-20AB液相色譜系統(tǒng)，分離柱為Gemini C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對樣品進(jìn)行分離，于214 nm波長處監(jiān)測洗脫峰并分別收集組分，然后凍干。每個(gè)取樣點(diǎn)樣品分別設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.6.2 數(shù)據(jù)依賴采集模式建庫和數(shù)據(jù)非依賴采集定量檢測

將肽段樣品用流動(dòng)相A（2%乙腈、0.1%甲酸）復(fù)溶，20 000×離心10 min后，取上清液通過UltiMate 3000超高效液相色譜儀進(jìn)行分離。樣品進(jìn)入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C柱串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下條件進(jìn)行分離：0～5 min，5%流動(dòng)相B（98%乙腈、0.1%甲酸）；5～120 min，5%～25%流動(dòng)相B；120～160 min，25%～35%流動(dòng)相B；160～170 min，35%～80%流動(dòng)相B；170～175 min，80%流動(dòng)相B；175～10 min，5%流動(dòng)相B。

數(shù)據(jù)依賴采集模式（data independent acquisition，DDA）檢測：經(jīng)過液相分離的肽段離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。參數(shù)設(shè)置：離子源電壓1.9 kV；一級質(zhì)譜掃描范圍350～1 500/；分辨率為120 000；二級質(zhì)譜起始/固定為100；分辨率30 000。二級碎裂的母離子：電荷2到6。離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。

數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent acquisition，DIA）檢測：離子源電壓設(shè)置為1.9 kV；一級質(zhì)譜掃描范圍/400～1 250；分辨率設(shè)置為120 000；最大離子注入時(shí)間50 ms；將/400～1 250均分為50 個(gè)窗口進(jìn)行連續(xù)窗口碎裂及信號采集。離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。

1.3.6.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定與分析

將滿足FDR≤1%的信息用于建立最終的譜圖庫，以差異倍數(shù)≥1和＜0.01作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選，同時(shí)對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析（http://www.geneontology.org）和KEGG通路（http://www.genome.jp/）功能注釋分析?；诙拷Y(jié)果，完成不同比較組差異表達(dá)蛋白的查找，最后進(jìn)行相應(yīng)差異富集蛋白的功能分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2013軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SAS 9.2軟件Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA處理對桃果實(shí)糖酸、總酚、總黃酮含量和花色苷含量的影響

如表2所示，共檢測到3 種可溶性糖，分別為蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖的含量最高。不同處理組隨著貯藏時(shí)間的延長，蔗糖含量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，而葡萄糖和果糖含量呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。與CK組相比，HA處理顯著抑制了桃蔗糖含量的下降（＜0.05），并抑制了果糖和葡萄糖含量的上升，這與Yu Lina等的研究結(jié)果是一致的。檸檬酸和蘋果酸是桃果實(shí)中的主要有機(jī)酸，不同處理組2 種有機(jī)酸隨著貯藏時(shí)間的延長整體呈現(xiàn)下降的趨勢，其中CK組檸檬酸含量下降了0.17 mg/g，蘋果酸含量下降了0.41 mg/g。與CK組相比，HA處理可在第7、14、28、35天顯著抑制檸檬酸含量的下降（＜0.05）。經(jīng)過HA處理14～35 d后桃果實(shí)蘋果酸的含量顯著高于CK組（＜0.05）。Chen Ming等研究表明HA處理可以顯著抑制椪柑果實(shí)檸檬酸和蘋果酸含量的下降。總酚含量和總黃酮含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CK組和處理組桃果實(shí)總酚含量于貯藏第21天達(dá)到最大值，分別為0.80 mg/g和1.07 mg/g，CK組總黃酮含量于貯藏第14天達(dá)到最大值（1.43 mg/g），而處理組總黃酮含量于第21天達(dá)到最大值，為1.93 mg/g。與對照組相比，HA處理顯著提高桃果實(shí)總酚含量和總黃酮含量，這與Wei Yingying等的研究結(jié)果一致。對照組桃果實(shí)花色苷含量變化比較穩(wěn)定，而HA處理組花色苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，HA處理顯著提高了桃果實(shí)花色苷含量。Zhou Dandan等研究結(jié)果表明，HA處理可顯著提高桃果肉花色苷含量不僅與苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活力有關(guān)，同時(shí)與果實(shí)中可溶性糖和有機(jī)酸含量密切相關(guān)。研究表明，蔗糖、葡萄糖和果糖與果實(shí)花色苷的合成呈現(xiàn)正相關(guān)性，糖不僅是合成花色苷重要的前體物質(zhì)，也是調(diào)節(jié)花色苷合成的重要信號物質(zhì)。Liu Xiaojuan等研究表明，蔗糖可以通過調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)蘋果花色苷的積累和果實(shí)色澤形成。有機(jī)酸含量決定了果實(shí)液泡內(nèi)pH值的變化，花色苷以陽離子的形式存在于果實(shí)液泡內(nèi)，顏色隨液泡中的pH值改變而變化。Noro等研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸和蘋果酸是蘋果花色苷合成的潛在刺激物。本研究表明，HA處理顯著提高桃果肉花色苷的含量與蔗糖、檸檬酸含量和蘋果酸含量密切相關(guān)，HA處理可以通過抑制桃果實(shí)蔗糖、檸檬酸和蘋果酸的降解從而提高花色苷的含量。

表2 HA處理對桃果實(shí)可溶性糖、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of HA treatment on the contents of soluble sugars,organic acids and phenolic compounds in peach fruit

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

對桃果實(shí)測序后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，總共獲得了518.05 Mb 個(gè)原始的reads片段，過濾后的clean reads片段為478.02 Mb 個(gè)，包含了47.81 Gb 個(gè)堿基數(shù)。其中過濾后質(zhì)量不低于20的reads比例大于97%，不低于30的reads比例約為90%。由此可以看出，測序質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)組裝及處理的要求。同時(shí)，利用qPCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，由圖1可知，qPCR檢測的9 個(gè)基因的相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組檢測的FPKM值具有較高的相關(guān)性，的最低值為0.795 1，最高值0.975 9，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠性較高。

圖1 基因表達(dá)量的qPCR驗(yàn)證分析Fig. 1 qPCR validation analysis of gene expression

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選

桃果實(shí)采后貯藏期間差異表達(dá)基因數(shù)量如圖2所示。以采收當(dāng)天的桃果實(shí)（CK0）為對照，分析不同貯藏時(shí)間下的差異表達(dá)基因。由圖2A可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，差異表達(dá)基因的數(shù)量不斷上升，CK0 vs CK7、CK0 vs CK21、CK0 vs CK35 3 組差異基因總數(shù)分別為8 182、11 345、11 884 個(gè)。且隨著貯藏時(shí)間的延長，下調(diào)差異基因總數(shù)始終高于上調(diào)差異基因總數(shù)，其中CK0 vs CK7、CK0 vs CK21和CK0 vs CK35分別有3 059、3 257 個(gè)和3 721 個(gè)基因上調(diào)，有5 123、8 088 個(gè)和8 163 個(gè)基因下調(diào)。圖2B為同一貯藏時(shí)間下CK組與HA處理組差異表達(dá)基因的數(shù)量，隨著貯藏時(shí)間的延長，CK組與HA處理組差異基因表達(dá)總數(shù)逐漸減少，CK7 vs HA7、CK21 vs HA21和CK35 vs HA35分別為2 424、2 287 個(gè)和746 個(gè)。貯藏前期（7 d），HA處理下調(diào)表達(dá)的差異基因數(shù)量高于上調(diào)的差異基因數(shù)量，但是在貯藏中期（21 d）和貯藏后期（35 d），HA處理上調(diào)的差異基因數(shù)量高于下調(diào)的差異基因數(shù)量。

圖2 桃果實(shí)貯藏過程中差異表達(dá)基因數(shù)量（A）和HA處理與對照組差異表達(dá)基因數(shù)量（B）Fig. 2 Number of DEGs in control group among storage times (A) and number of DEGs between HA treated and control groups (B)

2.2.3 差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果

將上述差異基因進(jìn)一步進(jìn)行GO功能分析，主要分為貯藏期間差異基因GO分析以及CK組和HA處理組差異基因GO分析。這些GO信息被進(jìn)一步被歸納為基因的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程3大類。圖3為對照組與HA組差異基因的GO分析結(jié)果，主要對比了CK7 vs HA7、CK21 vs HA21和CK35 vs HA35。由圖3可知，對于生物進(jìn)程中，差異基因主要聚集于細(xì)胞代謝過程、生物調(diào)控、刺激響應(yīng)和代謝過程這4 個(gè)亞類中。對于細(xì)胞組分歸類中，差異基因主要聚集于細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜組分和細(xì)胞器這4 個(gè)亞類中。對于分子功能，差異基因主要聚集于結(jié)合功能和催化活性這2 個(gè)亞類中。

圖3 桃果實(shí)HA組和對照組差異表達(dá)基因GO功能分類Fig. 3 Gene ontology (GO) term assignment of DEGs between control and HA-treated groups

2.2.4 差異表達(dá)基因代謝通路富集

通過KEGG通路分析可以進(jìn)一步了解相關(guān)基因的生物功能和相互間的作用。KEGG分類主要包括6大類，分別為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)。圖4為CK組和HA處理組差異基因的KEGG富集分析。CK組和HA處理組的差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中共映射到20 個(gè)不同的代謝通路。在6 個(gè)分類中，CK組和HA處理組差異基因在代謝中占比最多，其次為遺傳信息處理。在代謝這一分類中，差異基因主要集中在總概，其次為碳水化合物代謝、次級產(chǎn)物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝。在遺傳信息處理分類中，差異基因主要聚集在翻譯、折疊、分類和降解。此外HA處理組和CK組差異基因在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中占比也較多。

圖4 桃果實(shí)HA組和CK組差異表達(dá)基因KEGG代謝途徑分類分析Fig. 4 KEGG classification of DEGs between control and HA-treated groups

2.2.5 參與調(diào)控糖酸和酚類物質(zhì)代謝的差異基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對集中于糖酸代謝和酚類物質(zhì)代謝的差異基因的表達(dá)量進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。圖5為參與調(diào)控果實(shí)可溶性糖、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)代謝的差異表達(dá)基因。

圖5 參與桃果實(shí)糖代謝（A）、有機(jī)酸代謝（B）和酚類物質(zhì)代謝（C）的差異表達(dá)基因Fig. 5 DEGs involved in the metabolisms of soluble sugars (A), organic acids (B) and phenols (C) in peach fruit

如圖5A所示，共檢測到22 個(gè)參與調(diào)控桃果實(shí)糖代謝的差異表達(dá)基因，差異基因主要為、、、I、、和。蔗糖合酶（sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase，SPS）可以促進(jìn)葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，而蔗糖可在轉(zhuǎn)化酶的催化下降解生成葡萄糖和果糖；己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）參與果實(shí)糖酵解途徑，與果糖和葡萄糖的磷酸化反應(yīng)密切相關(guān)。貯藏前期，HA處理上調(diào)了、、、基因的表達(dá)量，其logFC均大于1；貯藏中后期，HA處理上調(diào)了基因的表達(dá)量。同時(shí)，HA處理抑制了桃果實(shí)和基因的表達(dá)量，其logFC均小于1。Yu Lina等研究表明，HA處理可以抑制桃蔗糖含量的降解主要與低表達(dá)量的和基因密切相關(guān)，同時(shí)HA處理抑制了葡萄糖和果糖含量的上升與高表達(dá)量的和密切相關(guān)。與上述結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)HA處理可以通過抑制和基因的表達(dá)，提高、和基因的表達(dá)，從而抑制了蔗糖的降解并抑制了葡萄糖和果糖的合成。

如圖5B所示，共檢測到29 個(gè)參與桃有機(jī)酸代謝的差異基因，主要參與蘋果酸和檸檬酸的代謝，差異基因主要為、、、、、和?？梢源呋瘷幟仕岬暮铣?，而和促進(jìn)檸檬酸的降解，和參與檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。和參與果實(shí)蘋果酸的合成，而促進(jìn)了蘋果酸的降解。貯藏前期，HA處理提高了桃果實(shí)、、、和基因的表達(dá)量，同時(shí)HA處理顯著抑制了、和基因的表達(dá)量。以上結(jié)果表明，HA處理通過提高桃果實(shí)、和基因的表達(dá)量，并抑制基因的表達(dá)量從而抑制桃果實(shí)檸檬酸含量的下降。對于蘋果酸代謝的影響，HA處理通過上調(diào)和的表達(dá)量，并抑制基因的表達(dá)，從而抑制桃蘋果酸含量的下降。

參與調(diào)控酚類物質(zhì)代謝的差異基因共檢測到24 個(gè)，主要集中于苯丙烷代謝途徑中，差異基因主要為、、、、、、、、和。、、可以催化果實(shí)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚酸類物質(zhì)，后經(jīng)過、和進(jìn)一步催化生成黃酮類和黃烷醇類物質(zhì)，、和參與果實(shí)花色苷的合成，促進(jìn)果實(shí)顏色的積累。本研究表明HA處理上調(diào)酚類代謝相關(guān)基因的表達(dá)量，尤其是在貯藏的前期。對、、和基因表達(dá)量影響較為顯著，logFC均大于2。以上結(jié)果表明，HA處理可以通過調(diào)控基因的表達(dá)量從而促進(jìn)桃果實(shí)苯丙氨酸向酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)通過上調(diào)、、和基因的表達(dá)量從而提高果實(shí)黃酮類物質(zhì)的含量，最后通過提高、和基因的表達(dá)量，從而促進(jìn)桃果實(shí)花色苷的合成。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 差異表達(dá)蛋白的篩選

桃果實(shí)采后貯藏期間差異表達(dá)蛋白數(shù)量如圖6所示。以采收當(dāng)天的桃果實(shí)為對照，分析了不同貯藏時(shí)間下的差異表達(dá)蛋白。由圖6A可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，差異表達(dá)蛋白的數(shù)量不斷上升，CK0 vs CK7組和CK0 vs CK35組的差異表達(dá)蛋白總數(shù)分別為160 個(gè)和951 個(gè)。在貯藏前期，上調(diào)蛋白數(shù)量和下調(diào)蛋白數(shù)量基本相等，貯藏后期，下調(diào)蛋白數(shù)量明顯高于上調(diào)蛋白的數(shù)量。圖6B為同一貯藏時(shí)間下CK組與HA處理組差異蛋白的數(shù)量，隨著貯藏時(shí)間的延長，CK組與HA處理組差異表達(dá)蛋白總數(shù)逐漸減少，CK0 vs HA7組和CK0 vs HA35組分別為401 個(gè)和339 個(gè)。貯藏前期和貯藏后期，HA處理下調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)蛋白數(shù)量高于上調(diào)的差異表達(dá)蛋白的數(shù)量。

圖6 桃果實(shí)貯藏過程中差異表達(dá)蛋白數(shù)量（A）和HA處理與CK組差異表達(dá)蛋白數(shù)量（B）Fig. 6 Number of DEPs in control group among storage times (A) and number of DEGs between HA treated and control groups (B)

2.3.2 差異表達(dá)蛋白GO功能分析結(jié)果

將CK組與HA處理組差異基因進(jìn)行GO功能分析，這些GO信息被進(jìn)一步歸納為基因的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程3大類。圖7為CK組與HA處理組差異表達(dá)蛋白的GO功能分析結(jié)果，主要對比了CK7 vs HA7和CK35 vs HA35。在3大類中，CK組和HA處理組差異表達(dá)蛋白數(shù)量在生物學(xué)過程中最多，其次為細(xì)胞組分，分子功能中差異表達(dá)蛋白數(shù)量最少。在43 個(gè)亞類中，細(xì)胞代謝過程、代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合和催化活性中差異表達(dá)蛋白數(shù)量較多。

圖7 桃果實(shí)HA組和對照組差異表達(dá)蛋白GO功能分類分析Fig. 7 Gene ontology (GO) term assignment of DEPs between control and HA-treated groups

2.3.3 差異表達(dá)蛋白代謝通路富集

KEGG分類主要包括細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)6大類。CK組和HA處理組差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析如圖8所示。CK組和HA處理組的差異表達(dá)蛋白共映射到20 個(gè)不同的代謝通路。在6 個(gè)分類中，代謝中差異基因的占比最多，差異表達(dá)蛋白主要參與了碳水化合物代謝、其他次級產(chǎn)物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等代謝途徑。差異表達(dá)蛋白在遺傳信息處理分類中占比也較多，主要集中在翻譯、折疊、分類和降解。

圖8 桃果實(shí)HA組和CK組差異表達(dá)蛋白KEGG代謝途徑分類Fig. 8 KEGG classification of DEPs between control and HA-treated groups

2.3.4 參與調(diào)控碳水化合物和次級代謝物代謝的差異表達(dá)蛋白

圖9為參與桃果實(shí)碳水化合物代謝和次級代謝物代謝的差異表達(dá)蛋白，共鑒定出44 個(gè)具有差異表達(dá)的蛋白，其中碳水化合物代謝差異表達(dá)蛋白有28 個(gè)，次級代謝物代謝差異表達(dá)蛋白有16 個(gè)。

圖9 參與桃果實(shí)碳水化合物（A）和次級代謝物（B）代謝的差異表達(dá)蛋白Fig. 9 DEPs involved in the metabolisms of carbohydrates (A) and secondary metabolites (B) in peach fruit

碳水化合物代謝中，差異表達(dá)蛋白主要集中在糖代謝、有機(jī)酸代謝及果實(shí)抗病防御系統(tǒng)酶。在果實(shí)抗病防御系統(tǒng)中，果膠乙酰酯酶（pectin acetylesterase，PAE），酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（acidic chitinase，ACHI）和葡聚糖內(nèi)-1,3--葡萄糖苷酶（glucan endo-1,3-glucosidase，-GAL）主要參與了植物抗病脅迫進(jìn)程，經(jīng)過HA處理后的桃果實(shí)CHI和-GAL的表達(dá)量高于CK組，說明HA處理可以誘導(dǎo)果實(shí)的抗病性。在糖代謝過程中，鑒定到的差異表達(dá)蛋白主要包括SS、淀粉酶、HK、PFK、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）、UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UDP-GT）和UDP-葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase，UDP-GDH）。與CK組相比，HA處理上調(diào)了SS、PFK、UDP-GT和UDP-GDH蛋白的表達(dá)量，說明HA處理可以抑制蔗糖含量的降解，并促進(jìn)果糖和葡萄糖的代謝。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析，共有3 個(gè)糖代謝差異表達(dá)蛋白與相應(yīng)的差異表達(dá)基因變化相同，分別為HK（18792370、ONI32405.1）、PFK（18771749、ONH97891.1）和PK（18777684、ONI06129.1）。在有機(jī)酸代謝過程中，差異表達(dá)蛋白主要參與檸檬酸和蘋果酸的代謝，鑒定的差異表達(dá)蛋白主要為蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）、檸檬酸裂解酶（ctric acid lyase，ACL）和蘋果酸異丙酯脫氫酶（isopropyl malate dehydrogenase，IMDH）。HA處理上調(diào)了MDH和CS蛋白的表達(dá)量，并下調(diào)了IDH、ACL和IMDH蛋白的表達(dá)量。其中MDH、IDH和CS蛋白的表達(dá)量變化與轉(zhuǎn)錄組中CS（18782404）、NAD-IDH（18781889）和MDH（18773149）基因的表達(dá)量變化相同，HA均提高了MDH和CS的表達(dá)，并抑制了IDH的表達(dá)。

圖9B為參與桃果實(shí)次級代謝物代謝的差異表達(dá)蛋白，共鑒定到16 個(gè)具有差異表達(dá)的蛋白，主要為苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵蛋白和糖苷轉(zhuǎn)移蛋白，差異表達(dá)蛋白主要為黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)S）、黃烷醇-3-羥化酶（flavanol-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶（9-epoxy carotenoid oxygenase，NCED）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CADH）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid glycosyltransferase，UFGT）。與CK組相比，HA處理提高了FS、PAL、UFGT等蛋白的表達(dá)量，從而促進(jìn)了桃果實(shí)苯丙氨酸向花色苷類物質(zhì)的合成。其中，PAL蛋白（ONI03046.1）與基因（18772065）的表達(dá)量變化一致；UFGT蛋白（ONI25885.1）和基因（18785045）表達(dá)量的變化相同，說明HA處理均能顯著提高PAL和UFGT蛋白和基因的表達(dá)。同時(shí)，HA處理明顯下調(diào)了ADH、NCED的表達(dá)量，說明HA處理可以顯著抑制果實(shí)類胡蘿卜素等物質(zhì)的降解。

3 結(jié) 論

HA處理（40 ℃、4 h）對桃果實(shí)糖代謝、有機(jī)酸代謝和酚類物質(zhì)代謝影響較大。HA處理可以有效抑制蔗糖、檸檬酸和蘋果酸含量的下降，并抑制了葡萄糖和果糖含量的上升。同時(shí)，HA處理顯著提高了桃果實(shí)總酚、總黃酮和總花色苷的含量。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，大多數(shù)的差異表達(dá)基因和蛋白主要集中在碳水化合物代謝和次級代謝物代謝途徑中。對于糖代謝途徑，HA處理通過抑制酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）的表達(dá)，并上調(diào)SS、SPS和PFK表達(dá)，從而抑制桃果實(shí)蔗糖含量的降解及果糖和葡萄糖含量的上升。對于有機(jī)酸代謝，檸檬酸和蘋果酸是桃果實(shí)的主要有機(jī)酸，HA處理通過上調(diào)CS表達(dá)并下調(diào)IDH和烏頭酸酶（aconitase，ACO）的表達(dá)量，從而抑制檸檬酸含量的下降，同時(shí)HA處理通過上調(diào)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和MDH并下調(diào)ME的表達(dá)量，從而抑制桃果實(shí)蘋果酸含量的下降。對于酚類和花色苷代謝，HA處理可以通過上調(diào)PAL和肉桂酸羥化酶（cinnamate hydroxylase，C4H）的表達(dá)量，從而促進(jìn)苯丙氨酸向下游酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，通過上調(diào)查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）和F3H表達(dá)量促進(jìn)桃果實(shí)黃酮類物質(zhì)的合成，并通過上調(diào)二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）、ANS和UFGT表達(dá)量，從而提高桃果實(shí)花色苷的含量。