秦士瑋，楊波，戴青，程林，劉職瑞（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038）

百合知母湯（Baihe-zhimu decoction，BZD）首載于張仲景《金匱要略》，由百合-知母藥對(duì)組成，其藥簡(jiǎn)力宏、療效確切，是至今臨床仍在沿用的抗抑郁方劑[1-2]。BZD的化學(xué)成分復(fù)雜，已有學(xué)者對(duì)知母中的甾體皂苷、黃酮苷類等成分及百合中的酚酸苷類等成分進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，知母皂苷BⅡ、知母皂苷E、知母皂苷AⅢ可顯著縮短強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中小鼠的不動(dòng)時(shí)間[3]；芒果苷和新芒果苷能夠改善脂多糖引起的動(dòng)物抑郁樣行為[4]；王百合苷A和王百合苷Ⅰ可通過(guò)升高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平而發(fā)揮抗抑郁活性[5]。既往研究已證實(shí)，BZD作為整方在治療抑郁癥時(shí)效果較單味藥更優(yōu)[6]，然而，已有的研究大多針對(duì)百合或知母藥材中單種或某幾種成分進(jìn)行考察，其結(jié)果難以有效解釋BZD配伍的科學(xué)性。

中藥方劑經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)后，各種成分之間容易發(fā)生復(fù)雜的相互作用，比如非直接藥效成分可能對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶有抑制或誘導(dǎo)作用，從而改變主要藥效成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，進(jìn)而影響中藥方劑的整體療效。因此，從藥動(dòng)學(xué)角度探討中藥方劑復(fù)雜體系對(duì)活性成分體內(nèi)過(guò)程的影響已成為揭示方劑配伍機(jī)制的有力手段之一[7]。鑒于此，本研究以BZD中已報(bào)道的7種抗抑郁有效成分（新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷E和知母皂苷AⅢ）為研究對(duì)象，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)BZD及其單味藥在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，以期為該經(jīng)典方劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30AD型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、AB QTRAP 5500型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

百合藥材（產(chǎn)地湖南）、知母藥材（產(chǎn)地內(nèi)蒙古）均購(gòu)自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)與中藥學(xué)教研室高寧教授鑒定均為真品。新芒果苷對(duì)照品、芒果苷對(duì)照品、王百合苷A對(duì)照品、王百合苷Ⅰ對(duì)照品、野黃芩苷對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)）均購(gòu)自上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，知母皂苷BⅡ?qū)φ掌贰⒅冈碥誆對(duì)照品、知母皂苷AⅢ對(duì)照品均購(gòu)自重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，純度均大于98%；乙腈和甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，共18只，體質(zhì)量為200～220 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 儲(chǔ)備液和工作液的配制

分別精密稱取新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷E、知母皂苷AⅢ、野黃芩苷（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品各適量，用甲醇溶解并稀釋成1 mg/mL的單一儲(chǔ)備液。臨用時(shí)，用甲醇將各儲(chǔ)備液稀釋成所需工作液。所有儲(chǔ)備液和工作液均于4℃下保存。

2.2 校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的配制

取“2.1”項(xiàng)下7種待測(cè)成分的工作液各10 μL，加至含930 μL空白血漿的1.5 mL EP管中，渦旋混勻2 min，再逐級(jí)稀釋成7個(gè)系列質(zhì)量濃度的校正標(biāo)樣，其中新芒果苷、芒果苷和知母皂苷BⅡ的系列質(zhì)量濃度均分別為1、4、10、40、100、400、1 000 ng/mL，王百合苷A和知母皂苷E的系列質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.4、1、4、10、40、100 ng/mL，王百合苷Ⅰ的系列質(zhì)量濃度分別為0.4、1.6、4、16、40、160、400 ng/mL，知母皂苷AⅢ的系列質(zhì)量濃度分別為0.5、2、5、20、50、200、500 ng/mL。同法制備定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，其中新芒果苷、芒果苷和知母皂苷BⅡ的質(zhì)量濃度均分別為1、2、50、800 ng/mL，王百合苷A和知母皂苷E的質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、5、80 ng/mL，王百合苷Ⅰ的質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、20、320 ng/mL，知母皂苷AⅢ的質(zhì)量濃度分別為0.5、1、25、400 ng/mL。

2.3 血漿樣品前處理

采用蛋白沉淀法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理。將凍存于-80℃下的血漿解凍，取50 μL置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入200 ng/mL野黃芩苷（內(nèi)標(biāo)）甲醇溶液，再加入450 μL甲醇，渦旋混勻2 min，在4℃下以13 500 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，取2 μL進(jìn)樣分析。

2.4 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件以Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）為色譜柱，以5 mmol/L乙酸銨溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，10%B→95%B；2～9 min，95%B；9～9.1 min，95%B→10%B；9.1～10 min，10%B）；柱溫為25℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行負(fù)離子掃描；氣簾氣壓力為25 psi；霧化氣壓力為40 psi，輔助加熱氣壓力為60 psi；離子源溫度為550℃；離子源電壓為-4 000 V。優(yōu)化后的監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 新芒果苷等待測(cè)成分的監(jiān)測(cè)參數(shù)

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 取6只大鼠的空白血漿、空白血漿+7種待測(cè)成分（定量下限質(zhì)量濃度）、給藥8 h后的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1，空白血漿色譜圖略）。結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷E、知母皂苷AⅢ和野黃芩苷（內(nèi)標(biāo)）的保留時(shí)間分別約為2.9、3.3、3.4、3.6、3.9、4.1、5.7、3.4 min，且峰形對(duì)稱，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 大鼠血漿中新芒果苷等7種待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系與定量下限 按“2.2”項(xiàng)下方法制備含7種待測(cè)成分的7個(gè)系列質(zhì)量濃度的校正標(biāo)樣，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。線性關(guān)系與定量下限考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 新芒果苷等7種待測(cè)成分的線性關(guān)系與定量下限考察結(jié)果

2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度 按“2.2”項(xiàng)下方法制備含定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的7種待測(cè)成分的質(zhì)控樣品，各平行5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)檢測(cè)3 d，考察日間精密度；以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度相比考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，新芒果苷等7種待測(cè)成分的日內(nèi)RSD為0.62%～14.35%（n＝5），日間RSD為1.32%～12.44%（n＝3），準(zhǔn)確度為87.50%～115.00%（n＝5）。

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備含低、中、高質(zhì)量濃度的7種待測(cè)成分的質(zhì)控樣品，各平行5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積（A1）。取不同大鼠的空白血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后再加入對(duì)照品工作液，使7種待測(cè)成分的質(zhì)量濃度與上述質(zhì)控樣品一致，同法測(cè)得峰面積（A2）。用水制備與上述7種待測(cè)成分質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度一致的對(duì)照品溶液，同法測(cè)得峰面積（A3）。以A1/A2×100%計(jì)算提取回收率，以A2/A3×100%計(jì)算基質(zhì)因子。結(jié)果顯示，新芒果苷等7種待測(cè)成分的提取回收率為91.20%～115.00%（n＝5）；基質(zhì)因子分別為92.00%～110.63%，RSD為2.68%～14.03%（n＝5）。

2.5.5 穩(wěn)定性 按“2.2”項(xiàng)下方法制備含低、中、高質(zhì)量濃度的7種待測(cè)成分的質(zhì)控樣品，各平行5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，考察其室溫（25℃）放置4 h、-80℃凍存3個(gè)月、凍融（-80℃～室溫）循環(huán)3次以及4℃放置8 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，新芒果苷等7種待測(cè)成分的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的偏差均在±15%范圍內(nèi)，表明在上述條件下各樣品均能保持穩(wěn)定。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 BZD提取液的制備 以質(zhì)量比3∶1為百合與知母的用量配比[8-9]，稱取百合粉末270.0 g、知母粉末90.0 g，加入70%乙醇900 mL，攪拌混勻，靜置1 h，80 Hz超聲30 min，經(jīng)脫脂棉花過(guò)濾后，向?yàn)V液中緩慢加入95%乙醇9 000 mL，期間不斷攪拌以沉淀多糖和蛋白，在4℃下放置12 h，經(jīng)脫脂棉花過(guò)濾后，在60℃、160 MPa下以90 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得提取液濃縮液，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解制成混懸液，質(zhì)量濃度為2.4 g/mL（按生藥量計(jì)，下同）。

2.6.2 單味藥材提取液的制備 分別稱取百合粉末270.0 g、知母粉末90.0 g，按“2.6.1”項(xiàng)下方法提取，制成知母提取液（0.6 g/mL）和百合提取液（1.8 g/mL）。

2.6.3 給藥與取樣 將大鼠隨機(jī)分為知母組（3 g/kg）、百合組（9 g/kg）和BZD組（12 g/kg），每組6只，分別灌胃相應(yīng)提取液1 mL（參考文獻(xiàn)[3]和2020年版《中國(guó)藥典》，按物種等效劑量換算給藥量[10]）。各組大鼠給藥前禁食不禁水12 h，于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.2 mL，置于抗凝管中，以2 500 r/min離心5 min，取血漿于-80℃保存。

2.6.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS 3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）、平均滯留時(shí)間（MRT）、清除率（CLz/F）和峰濃度（cmax）先進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，消除半衰期（t1/2z）、血藥濃度達(dá)峰時(shí)間（tmax）進(jìn)行非參數(shù)K-S檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與知母組或百合組比較，BZD組中大部分有效成分的MRT0-24h、t1/2z和tmax均無(wú)顯著變化；7種有效成分的AUC0-24h、AUC0-∞和cmax均顯著增加（P＜0.05）；除知母皂苷BⅡ的CLz/F顯著增加外（P＜0.05），其余6種有效成分的CLz/F均顯著降低（P＜0.05）。血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 大鼠體內(nèi)新芒果苷等7種有效成分的血藥濃度-時(shí)間曲線

表3 新芒果苷等7種有效成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

3.1 前處理方法和色譜條件的優(yōu)化

筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了液液萃取、固相萃取和蛋白沉淀（以甲醇、乙腈、含0.1%甲酸的甲醇和含0.1%甲酸的乙腈為沉淀劑）3種前處理方法的提取效率，發(fā)現(xiàn)以甲醇為沉淀劑的蛋白沉淀法簡(jiǎn)便、快捷，獲得的色譜峰峰形更好，靈敏度更高；比較了Zorbax SB C18、Acquity BEH C18、Agilent Poroshell EC-C18等色譜柱對(duì)待測(cè)成分出峰的影響，發(fā)現(xiàn)以Agilent Poroshell EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）為色譜柱時(shí)，待測(cè)成分可獲得更好的分離度和信噪比；比較了甲醇-水和乙腈-水的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水的洗脫效果更好，但僅以純水作為水相時(shí)色譜峰有拖尾現(xiàn)象，可通過(guò)添加5 mmol/L乙酸銨加以消除，故最終確定5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇為流動(dòng)相。

3.2 血藥濃度-時(shí)間曲線中雙峰現(xiàn)象的分析

知母皂苷BⅡ和知母皂苷E的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，大鼠灌胃知母藥材提取液和BZD提取液后，二者的血藥濃度-時(shí)間曲線均呈現(xiàn)明顯的雙峰，這種現(xiàn)象與之前的報(bào)道相符[11]；而同屬于甾體皂苷的知母皂苷AⅢ的血藥濃度-時(shí)間曲線呈現(xiàn)單峰，表現(xiàn)出與知母皂苷BⅡ、知母皂苷E不同的藥動(dòng)學(xué)行為，這可能與呋甾皂苷（知母皂苷BⅡ、知母皂苷E）和螺甾皂苷（知母皂苷AⅢ）的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[12]。此外，藥物的吸收過(guò)程受胃排空、循環(huán)前代謝/排出、肝腸循環(huán)、藥物與藥物的相互作用等影響，任一因素的改變都會(huì)導(dǎo)致不規(guī)則的吸收現(xiàn)象。知母皂苷BⅡ的膽汁排泄指數(shù)較高（43.1%～44.9%）[13]，由此推測(cè)，肝腸循環(huán)也可能是引起呋甾皂苷類成分出現(xiàn)雙峰的原因。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃BZD提取液后，王百合苷A和王百合苷Ⅰ的血藥濃度-時(shí)間曲線也出現(xiàn)了明顯的雙峰，而灌胃百合藥材提取液時(shí)無(wú)此現(xiàn)象，這可能是組方后相關(guān)成分的吸收發(fā)生改變所致[11]。

3.3 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

比較BZD組方前后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，7種有效成分中大部分的MRT0-24h、t1/2z和tmax幾乎不受配伍影響；而在BZD組方后，7種有效成分的AUC0-24h、AUC0-∞和cmax均顯著增加，除知母皂苷BⅡ外的6種有效成分的CLz/F均顯著降低。上述結(jié)果表明，BZD組方可增加有效成分在體內(nèi)的吸收，減緩其消除，延長(zhǎng)其滯留時(shí)間，印證了百合-知母藥對(duì)相須為用、相輔相成的功效。

綜上所述，與百合或知母單味藥材相比，BZD的有效成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為更具優(yōu)勢(shì)，這為該方的組方提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；但7種有效成分體內(nèi)吸收增加且消除減緩是否可帶來(lái)BZD藥理效應(yīng)的增強(qiáng)，仍需進(jìn)一步研究。