榮華，張靜艷，劉京，張曉杰#（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 50040；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 6006）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人群，常伴有運(yùn)動(dòng)缺陷癥狀，黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及路易小體的形成是該疾病的典型病理特征[1]。目前，除首選外源性補(bǔ)充多巴胺來治療PD外，中醫(yī)藥防治PD具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PD病機(jī)以肝腎為本，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)為標(biāo)[3]。震顫和身體搖動(dòng)是中醫(yī)藏象學(xué)說中肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)的病理表現(xiàn)，肝陽上亢證是PD的主要證型，治以補(bǔ)腎柔肝、潛陽熄風(fēng)[4]。以往研究采用單一的PD病理學(xué)模型，這很難體現(xiàn)抗PD中藥病證兼顧的作用特點(diǎn)。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯為《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的經(jīng)典方劑，在治療肝陽上亢型PD中有著顯著效果[5]，但是其復(fù)方成分繁多，藥味之間關(guān)系作用復(fù)雜，研究難度較大。牛膝-白芍作為鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對(duì)，在治療PD的方劑中出現(xiàn)較多，牛膝補(bǔ)益肝腎、引火下行，白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙，兩藥成對(duì)，可奏補(bǔ)腎柔肝、潛陽熄風(fēng)之功[6]。本課題組前期研究結(jié)果提示，在體外實(shí)驗(yàn)中牛膝和白芍的有效成分可抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有協(xié)同增效的保護(hù)作用[7]。基于此，本研究采用病證結(jié)合的動(dòng)物模型，探討牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響，旨在為該藥對(duì)治療PD的機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Stratagene Mx3005P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Agilent公司），ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽、JYCZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），HT7800型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

附子、牛膝、白芍飲片（批號(hào)分別為000001294、001001502、001001168）均購(gòu)于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院李曉明副研究員鑒定均為真品。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，批號(hào)M0896）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；兔源酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（批號(hào)J5248）購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；兔源硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase 1，Trxr1）、核纖層蛋白B（lamin B）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)分別為 1、1345S、2118S）均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔源硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，Txnip）、核因子 E2相關(guān)因子 2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號(hào)分別為ab188865、ab137550）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、SP免疫組化法試劑盒（批號(hào)分別為00051405、0011404）均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為BC1315、BC0170、BC0020）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)，具體見表1。

表1 Nrf 2等引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度

1.3 動(dòng)物

C57BL/6雄性小鼠，共60只，3月齡，體質(zhì)量（25±2）g，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXF（蘇）2015-0001。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批件號(hào)為（齊）倫審〔2021〕127號(hào)。

2 方法

2.1 藥液的制備

分別取附子、牛膝、白芍飲片，按照傳統(tǒng)煎藥法制備附子、牛膝、白芍、牛膝-白芍藥對(duì)煎液，質(zhì)量濃度分別為0.20、0.33、0.17、0.50 g/mL（以生藥量計(jì)，下同）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯參考文獻(xiàn)[8]制備，質(zhì)量濃度為1.67 g/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組（25 g/kg）、牛膝組（4.5 g/kg）、白芍組（2.3 g/kg）及牛膝-白芍藥對(duì)組（6.8 g/kg），每組10只。除正常對(duì)照組外，其他組采用附子煎液（4 g/kg）灌胃給藥4周復(fù)制肝陽上亢型小鼠模型；附子灌胃結(jié)束后，腹腔注射MPTP（25 mg/kg）7 d，復(fù)制肝陽上亢型PD小鼠模型。在每次注射MPTP1 h后，除正常對(duì)照組和模型組小鼠灌胃生理鹽水外，其余各組小鼠分別灌胃對(duì)應(yīng)藥液，在MPTP腹腔注射7 d后，繼續(xù)給予7 d，給藥劑量參考文獻(xiàn)[9]設(shè)置。

2.3 小鼠行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1 易激惹程度評(píng)分 參考文獻(xiàn)[10]，造模結(jié)束后，對(duì)小鼠易激惹程度進(jìn)行評(píng)分。Ⅰ級(jí)：捉持頸部時(shí)尖叫、驚跳；Ⅱ級(jí)：捉持頸部時(shí)咬人；Ⅲ級(jí)：提尾時(shí)尖叫、驚跳甚至咬人或與同籠小鼠頻繁打斗；上述情況不明顯為0級(jí)。

2.3.2 麻痹震顫評(píng)分 參考文獻(xiàn)[11]，造模結(jié)束后，對(duì)小鼠麻痹震顫進(jìn)行評(píng)分。0分：與正常小鼠相似，無任何癥狀；1分：出現(xiàn)豎毛、弓背、間斷性細(xì)小震顫，但活動(dòng)自如；2分：出現(xiàn)吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，顫尾，活動(dòng)逐漸受限；3分：出現(xiàn)流涎，持續(xù)性震顫，四肢僵硬，活動(dòng)受限；4分：因全身麻痹而死亡。

2.3.3 懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分 參考文獻(xiàn)[12]，造模結(jié)束后，將各組小鼠倒置懸掛在長(zhǎng)為30 cm、高為25 cm的鐵絲上，將兩前爪置于鐵絲中點(diǎn)處，而后放開小鼠，如小鼠雙后爪抓住鐵絲則得0分，如小鼠后爪反復(fù)抓取鐵絲且可間斷抓握則得0.5分，如小鼠單只后爪抓握鐵絲則得1分，如小鼠雙后爪均不能抓握鐵絲則得2分，檢測(cè)時(shí)間為2 min。

2.3.4 游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)分 參考文獻(xiàn)[13]，造模結(jié)束后，將各組小鼠放置于40 cm×30 cm×20 cm規(guī)格的水箱中，水溫為（25±2）℃，水深為15 cm，記錄小鼠3 min內(nèi)的漂浮時(shí)間。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：漂浮0～30 s，記0分；漂浮31～90 s，記1分；漂浮91～150 s，記2分；漂浮151～180 s，記3分。

2.4 小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)觀察

藥物干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)取5只小鼠，處死后，冰上快速取小鼠腦黑質(zhì)，大小約1 mm3，將腦黑質(zhì)置于2.5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙酮、環(huán)氧樹脂浸透，環(huán)氧樹脂包埋，制備半薄切片和超薄切片，進(jìn)行雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化。

2.5 小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的檢測(cè)

采用SP免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下腦黑質(zhì)適量，固定于4%多聚甲醛溶液中，4℃保存72 h，脫水浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋，制備冠狀切片，脫蠟、水化處理后，抗原修復(fù)，滴加TH抗體（稀釋比例為1∶100），孵育過夜；磷酸鹽緩沖液漂洗后滴加二抗孵育10 min，DAB工作液顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染，清水充分清洗反藍(lán)，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的表達(dá)情況，采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度（平均光密度值越高表示TH陽性神經(jīng)元表達(dá)越強(qiáng)）。

2.6 小鼠腦黑質(zhì)相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

采用生物化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。取剩余5只小鼠，處死后，冰上快速取小鼠腦黑質(zhì)，與“2.4”項(xiàng)下腦黑質(zhì)合并，并滴加預(yù)冷的生理鹽水制備組織勻漿液，低溫離心后取上清液，依據(jù)相關(guān)試劑盒說明書測(cè)定T-AOC、MDA的含量及SOD活性。

2.7 小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1和Txnip mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下腦黑質(zhì)適量，使用Trizol試劑提取腦黑質(zhì)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模版2 μL，dNTP溶液1.6 μL，上、下游引物各 0.8 μL，BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq DNA Polymerase 0.1 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nrf2、Trxr1和Txnip mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1和Txnip蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下腦黑質(zhì)適量，提取各組小鼠腦黑質(zhì)總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白含量，將蛋白變性后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Nrf2、Trxr1、Txnip、lamin B和GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶1 000），4℃過夜；加入生物素標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1∶1 000），于室溫下孵育2 h，TBST洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使用Image J軟件對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行密度掃描。以Nrf2與內(nèi)參蛋白lamin B，Trxr1、Txnip與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值表示Nrf2、Trxr1和Txnip蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Ridit分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠易激惹程度的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠性情暴躁，易激惹程度Ⅱ、Ⅲ級(jí)小鼠只數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組易激惹程度Ⅰ級(jí)小鼠只數(shù)均增加，Ⅱ、Ⅲ級(jí)小鼠只數(shù)均減少，大部分組別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組易激惹程度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)小鼠只數(shù)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組、白芍組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3.2 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠麻痹震顫水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠麻痹震顫情況嚴(yán)重，得分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠麻痹震顫情況均有不同程度改善，得分均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠得分均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)分的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)得分均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)得分均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠得分均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核清晰可見，游離核糖體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，核周隙增寬，線粒體腫脹，游離核糖體減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較完好；牛膝組和白芍組小鼠腦黑質(zhì)核固縮減輕不明顯；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠腦黑質(zhì)核固縮減輕，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。結(jié)果見圖1（圖中箭頭指向細(xì)胞核變化部位）。

圖1 各組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖（×13 000）

3.5 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)水平均顯著高于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)結(jié)果（±s，n＝5）

表3 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)結(jié)果（±s，n＝5）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對(duì)組比較，P＜0.05

平均光密度0.28±0.04bc 0.26±0.06bc 0.46±0.02b組別正常對(duì)照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組平均光密度0.57±0.02 0.16±0.04a 0.49±0.06b組別牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對(duì)組

3.6 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達(dá)水平均顯著降低，MDA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組（除白芍組外）小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達(dá)水平均顯著升高，MDA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達(dá)水平均顯著高于牛膝組、白芍組，MDA表達(dá)水平均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），上述指標(biāo)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

表4 各組小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對(duì)組比較，P＜0.05

MDA/（mol/mg）7.12±1.53 17.28±5.24a 9.61±1.26b 13.44±3.21bc 15.47±5.10c 10.07±2.54b組別正常對(duì)照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對(duì)組T-AOC/（mol/mg）1.75±0.24 0.52±0.10a 1.38±0.35b 0.81±0.33bc 0.60±0.17c 1.34±0.28b SOD/%100.00 35.24±13.26a 69.09±8.41b 50.21±10.63bc 41.24±7.15c 68.96±6.38b

3.7 牛膝-白芍藥對(duì)對(duì)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Txnip mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Txnip mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對(duì)組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著高于牛膝組、白芍組，Txnip mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），上述指標(biāo)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5、圖2。

表5 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n＝5）

表5 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n＝5）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對(duì)組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對(duì)組mRNA相對(duì)表達(dá)量Nrf2 1.00±0.08 1.17±0.24 2.01±0.11b 1.35±0.41bc 1.32±0.26bc 1.89±0.24b Trxr1 1.00±0.13 1.12±0.03 1.86±0.23b 1.25±0.16bc 1.20±0.09bc 1.66±0.09b Txnip 1.00±0.15 2.28±0.35a 1.44±0.41b 1.81±0.20bc 1.91±0.10bc 1.50±0.21b蛋白表達(dá)水平/%Nrf2 100.00 110.14±16.82 277.31±26.25b 157.36±19.42bc 150.11±24.15bc 265.27±19.52b Trxr1 100.00 107.35±19.25 289.54±34.15b 146.58±19.21bc 139.61±11.19bc 276.13±10.45b Txnip 100.00 290.36±12.15a 144.21±22.46b 234.59±19.70bc 261.10±14.21bc 138.64±16.33b

圖2 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip蛋白表達(dá)電泳圖

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PD屬于“顫證”范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有“諸風(fēng)掉眩、皆屬于肝”的描述[14]。肝陽上亢是PD常見證候，附子味辛干，大熱，久用耗傷精血，奪肝腎之陰而使肝腎陰虛，陰不潛陽而肝陽偏亢，因此灌服附子可復(fù)制肝陽上亢模型[15]。MPTP可引起靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物腦黑質(zhì)和紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元死亡，這與PD的病理改變類似[16]。本研究采用附子煎液聯(lián)合MPTP誘導(dǎo)復(fù)制肝陽上亢型PD小鼠模型，用于考察牛膝-白芍藥對(duì)PD的干預(yù)作用，充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨病與辨證結(jié)合的特色。

臨床研究報(bào)道，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯防治肝陽上亢型PD效果明顯[17]，但是中藥復(fù)方復(fù)雜，導(dǎo)致中醫(yī)方劑內(nèi)涵實(shí)質(zhì)難以被揭示。藥對(duì)是方劑組成的最小單位，也是方劑配伍的精華與核心所在。牛膝-白芍是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對(duì)：牛膝補(bǔ)益肝腎、引火下行，在抗氧化及免疫調(diào)節(jié)方面有一定功效；白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙，有較好的神經(jīng)保護(hù)及抗炎作用[18]，兩藥聯(lián)用起到與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯相似的抗PD作用和“鎮(zhèn)肝熄風(fēng)”作用。TH作為檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元的金標(biāo)準(zhǔn)，可以反映出神經(jīng)元的位置和數(shù)量，用來判斷MPTP誘導(dǎo)的PD模型的嚴(yán)重程度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，牛膝-白芍藥對(duì)能夠顯著改善模型小鼠易激惹的程度，減輕麻痹震顫現(xiàn)象，增加小鼠懸掛和游泳的時(shí)間，增加小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)水平，對(duì)細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)變化所有改善，且牛膝-白芍藥對(duì)的效果強(qiáng)于牛膝、白芍單味藥材，與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的效果相近。

有關(guān)報(bào)道闡述，氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致PD等諸多神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素[20]。T-AOC、SOD和MDA是反映氧化應(yīng)激的常用檢測(cè)指標(biāo)，能夠表達(dá)抗氧化損傷的能力及氧化損傷的程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD的表達(dá)水平均顯著降低，而MDA表達(dá)水平顯著升高，說明模型小鼠腦氧化損傷程度較高；而各給藥組可抑制肝陽上亢型PD小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，且牛膝-白芍藥對(duì)的效果強(qiáng)于牛膝、白芍單味藥材，與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的效果相近。

Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，能夠激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答，是抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者[22]。Trxr1具有調(diào)節(jié)氧化還原、激活轉(zhuǎn)錄因子和防治PD等多種生物活性，Nrf2可直接與Trxr1啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合從而促進(jìn)Trxr1表達(dá)[23]。Txnip是氧化應(yīng)激效應(yīng)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控蛋白，過度表達(dá)時(shí)可使細(xì)胞更易發(fā)生氧化應(yīng)激甚至凋亡[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2和Trxr1表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較均無顯著差異，Txnip表達(dá)升高，而牛膝-白芍藥對(duì)可上調(diào)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1的表達(dá)水平，下調(diào)負(fù)反饋因子Txnip的表達(dá)水平，這說明牛膝-白芍藥對(duì)可調(diào)控上述因子的表達(dá)，從而起到抗PD的作用。

綜上所述，牛膝-白芍藥對(duì)具有改善肝陽上亢型小鼠PD樣行為的作用，可能以Nrf2為靶點(diǎn)抑制肝陽上亢型PD小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平，對(duì)腦部神經(jīng)起到保護(hù)作用，且效果優(yōu)于牛膝、白芍單味藥材，能夠發(fā)揮與組方相當(dāng)?shù)难a(bǔ)腎柔肝、潛陽熄風(fēng)的功效。