馮海林，彭崇勝，李曉波（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo是蘭科石斛屬多年生草本植物，藥用歷史悠久，是石斛藥材來源的主要品種之一[1]。鐵皮石斛的傳統(tǒng)藥用部位是莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可用于治療熱病津傷、口干煩渴、陰虛火旺、骨蒸勞熱等證[2]。鐵皮石斛葉與莖的化學(xué)成分相似[3]，具有良好的降血糖[3]、抗氧化[4]等功效，但其降血糖的活性成分還未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，石斛屬植物是小分子α-葡萄糖苷酶抑制劑的重要來源，例如：美花石斛莖中的菲類和茋類成分（loddigesiinols G～J）[5]、曲軸石斛中的新型芴-二氫菲類（dendrogibsol）和二氫菲成分（lusianthridin）[6]、鐵皮石斛莖中的菲類成分（3，4-二羥基-4′，5-二甲氧基聯(lián)苯和dendrocandin U）[7]，提示石斛屬植物中小分子成分可能通過抑制α-葡萄糖苷酶活性發(fā)揮降血糖作用。然而，鐵皮石斛葉中含量豐富的黃酮碳苷類成分[3]對α-葡萄糖苷酶的抑制活性尚未見報道。為了解鐵皮石斛葉中黃酮碳苷類成分對α-葡萄糖苷酶活性的影響，本研究采用大孔吸附樹脂和制備型高效液相色譜（HPLC）法對鐵皮石斛葉中的黃酮碳苷類成分進行分離和純化，通過紫外光譜（UV）、核磁共振（NMR）、高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜（HR-ESI-MS）等波譜方法對化合物結(jié)構(gòu)進行推導(dǎo)和鑒定；通過體外實驗方法評價各化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Bruker AVANCE 600型NMR波譜儀（美國Bruker BioSpin公司），6545型四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀、1200型HPLC儀、1260 InfinityⅡ制備型HPLC儀（美國Agilent公司），Nicolet 6700型紅外光譜（IR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），UV-1102型紫外可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司），P-2000型旋光儀、J-1500型圓二色光譜儀（日本JASCO公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鐵皮石斛葉由浙江鐵楓堂生物科技股份有限公司提供，經(jīng)上海交通大學(xué)藥學(xué)院彭崇勝副教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo的葉。α-葡萄糖苷酶（來源于釀酒酵母）購自美國Sigma-Aldrich公司；對-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（p-nitrophenylα-D-glucopyranoside，pNPG）購自上海麥克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附樹脂（規(guī)格0.3～1.2 mm）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.81）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；阿卡波糖片（批號BJ60665，規(guī)格50 mg）購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離

取干燥的鐵皮石斛葉250 g，粉碎，加20倍量（mL/g）純水，加熱回流提取2次，每次2 h。水提物趁熱過濾后減壓濃縮至800 mL，再用無水乙醇室溫醇沉24 h；將醇沉后的上清液抽濾，濾液減壓濃縮至250 mL，經(jīng)D101型大孔吸附樹脂吸附，以甲醇-水（0∶10、1∶9、1∶4、3∶7、3∶2、19∶1，V/V）梯度洗脫，減壓濃縮并真空干燥得6個主流分（Fr.1～Fr.6）。Fr.2～Fr.3采用制備型HPLC儀純化得到以下化合物：化合物1[45 mg，由Fr.2經(jīng)甲醇-水（50∶50，V/V）洗脫所得]、化合物2[13 mg，由Fr.2經(jīng)甲醇-水（50∶50，V/V）洗脫所得]、化合物3[14 mg，由Fr.3經(jīng)甲醇-水（50∶50，V/V）洗脫所得]、化合物4[25 mg，由Fr.3經(jīng)甲醇-水（50∶50，V/V）洗脫所得]、化合物5[11 mg，由Fr.3經(jīng)甲醇-水（50∶50，V/V）洗脫所得]。

2.2 化合物1～5的結(jié)構(gòu)式

采用HR-ESI-MS、UV、IR，一維/二維NMR譜和圓二色光譜等方法推導(dǎo)了化合物1的結(jié)構(gòu)式；通過測定HR-ESI-MS和NMR氫譜、碳譜（1H-NMR、13C-NMR），并與文獻比較，鑒定了化合物2～5的結(jié)構(gòu)?；衔?～5的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1～5的結(jié)構(gòu)式

2.2.1 化合物1 化合物1為淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇，[α]25D-15.82（c 0.01，MeOH）；UV在波長270、335 nm處有最大吸收；IR提示含有羥基（3 385 cm-1）、芳香環(huán)（1 629、1 575、836 cm-1）和芳香酮（1 648 cm-1）。推測化合物1為黃酮碳苷。HR-ESI-MS顯示質(zhì)荷比（m/z）為561.161 1[M-H]-（計算值561.161 4），可推出該化合物的分子式為C27H30O13。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）譜（表1）在低場區(qū)顯示出5組信號：δH14.04（1H，s，D2O交換）為黃酮母核5-OH的特征信號；δH8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′）和δH6.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′）為 1組AA′BB′耦合系統(tǒng)信號，提示結(jié)構(gòu)中有對位取代苯環(huán)；δH6.81（1H，s）可歸屬黃酮母核上 H-3的信號；δH10.25、6.08（各1H，s，D2O交換）提示黃酮母核上另有2個羥基取代；δH4.67、5.02（各1H）是糖端基氫信號。上述數(shù)據(jù)提示化合物1為芹菜素6，8-C-二糖苷，該化合物在ESI-MS/MS負(fù)離子模式下存在1組診斷離子（m/z為353.066 2、325.071 7、311.056 1、297.076 6），進一步確證了芹菜素6，8-C-二糖苷的推斷[8]。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）譜（表1）顯示出2組糖基碳信號（10個次甲基信號：δC67.8，71.7，71.8，72.2，73.8，74.1，74.5，75.1，75.8，77.3；2個甲基信號：δC17.2，18.3），提示結(jié)構(gòu)中存在鼠李糖和（或）異鼠李糖。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）譜（表1）顯示出1組信號[δH8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.81（1H，s，H-3），5.02（1H，s，H-1″），1.25（3H，d，J＝5.5 Hz，H-6″）]，與文獻[9]報告的芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖一致，提示結(jié)構(gòu)中具有6-C-α-L-鼠李糖基取代。與 6-C-α-L-鼠李糖基芹菜素[6]比較，化合物1的1H-NMR數(shù)據(jù)多出1組脫氧己糖信號[δH4.67（1H，d，J＝9.8 Hz，H-1″′），1.18（3H，d，J＝6.2 Hz，H-6″′）]，而無H-8信號。因此，化合物1的結(jié)構(gòu)可能是芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-α-L-鼠李糖或芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-α-L-異鼠李糖。二級質(zhì)譜中觀察到化合物1連續(xù)脫去C3H6O2和C4H8O3中性碎片而產(chǎn)生m/z分別為487.124 5和457.113 7的離子[8]；碎片離子m/z457.113 7繼續(xù)脫去C2H4O、C3H6O2和C4H8O3中性碎片分別產(chǎn)生m/z分別為413.087 7、383.077 1和353.066 2的離子，確證該化合物為6，8-C-二糖苷的推斷。進一步分析化合物1的1H-NMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，8位糖基的端基氫信號[δH4.67（1H，9.8 Hz）]與abyssionside A的8-C-β-D-異鼠李糖基[10]一致，而與香葉木素的8-C-α-L-鼠李糖苷基[δH5.43（2H，br s）]顯著不同[11]。因此，推測化合物1的結(jié)構(gòu)為芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-異鼠李糖。

表1 化合物1的1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）和13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）數(shù)據(jù)

異核多鍵相關(guān)（heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy，HMBC）譜中觀察到5-OH的氫信號與C-5、C-6、C-7和6-C-α-L-鼠李糖基的C-1″相關(guān)；而6-C-α-L-鼠李糖基的端基氫H-1″與C-5、C-6、C-7及6-C-α-L-鼠李糖基的C-2″、C-5″相關(guān)；8-C-β-D-異鼠李糖基的端基氫H-1″′與C-7、C-8、C-9及8-C-α-L-異鼠李糖基的C-2″′、C-3″′相關(guān)（圖2）。圖2給出了糖基部分氫原子相關(guān)光譜（1H correlation spectroscopy，1H COSY）信號，確認(rèn)了氫信號歸屬。核歐沃豪斯效應(yīng)譜（nuclear Overhauser effect spectroscopy，NOESY）中，H-2′/6′與8-C-β-D-異鼠李糖基的H-1″′、H-2″′相關(guān)，進一步確證了8-C-β-D-異鼠李糖基位置；而H-4″′與H-6″′相關(guān)，結(jié)合端基氫H-1″′與H-2″′之間的耦合常數(shù)（J＝9.8 Hz）進一步確證了相對構(gòu)型（圖3）?；衔?的圓二色光譜結(jié)果顯示，在波長275 nm處呈現(xiàn)負(fù)Cotton效應(yīng)，與芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-異鼠李糖的計算結(jié)果一致，支持8-C-β-D-異鼠李糖的構(gòu)型。二維NMR譜和圓二色光譜支持化合物1的結(jié)構(gòu)為芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-異鼠李糖。

圖2 化合物1的主要1H COSY和HMBC相關(guān)信號

圖3 化合物1的主要NOESY相關(guān)信號

2.2.2 化合物2 化合物2為淡黃色無定形粉末，UV在波長270、335 nm處有最大吸收，HR-ESI-MS顯示m/z為563.141 1[M-H]-（計算值563.140 6），推測化合物的分子式為C26H28O14。二級質(zhì)譜給出1組診斷離子（m/z為353.067 0、325.072 0、311.056 9、297.077 2），說明該化合物具有芹菜素-6，8-C-二糖苷結(jié)構(gòu)[8]。碎片離子m/z353.067 0脫去1個C4H8O4和1個C3H6O3，未出現(xiàn)同時脫去2個C4H8O4的情況，說明結(jié)構(gòu)中存在1個六碳糖基和1個五碳糖基[5]。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.74（1H，s，加D2O后消失，5-OH），7.99（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.90（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.75（1H，s，H-3），5.01（1H，d，J＝10.0 Hz，H-1″′），4.58（1H，d，J＝9.7 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.6（s，C-2），102.6（d，C-3），182.2（s，C-4），159.2（s，C-5），108.2（s，C-6），161.2（s，C-7），105.1（s，C-8），155.2（s，C-9），103.1（s，C-10），121.7（s，C-1′），128.8（d，C-2′/6′），115.9（d，C-3′/5′），160.0（s，C-4′），73.8（d，C-1″），70.4（d，C-2″），78.9（d，C-3″），71.1（d，C-4″），81.9（d，C-5″），61.3（d，C-6″），75.0（d，C-1″′），69.8（d，C-2″′），73.9（d，C-3″′），68.8（d，C-4″′），70.6（d，C-5″′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12-13]基本一致，故鑒定化合物2為夏佛塔苷（schaftoside）。

2.2.3 化合物3 化合物3為淡黃色無定形粉末，UV在波長270、335 nm處有最大吸收，HR-ESI-MS顯示m/z為563.141 1[M-H]-（計算值563.140 6），推測化合物的分子式為C26H28O14，可能為化合物2的同分異構(gòu)體。1HNMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：14.04（1H，s，加D2O后消失，5-OH），10.29（1H，br s，加D2O后消失，7-OH），8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.83（1H，s，H-3），4.76（1H，d，J＝10.0 Hz，H-1″′），4.67（1H，d，J＝9.8 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.9（s，C-2），102.8（d，C-3），182.4（s，C-4），159.0（s，C-5），107.7（s，C-6），161.3（s，C-7），102.8（s，C-8），154.9（s，C-9），103.7（s，C-10），121.5（s，C-1′），128.7（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3'/5'），161.3（s，C-4′），74.0（d，C-1″），69.2（d，C-2″），78.9（d，C-3″），71.1（d，C-4″），81.2（d，C-5″），60.1（d，C-6″），74.0（d，C-1″′），70.6（d，C-2″′），78.1（d，C-3″′），70.2（d，C-4″′），81.2（d，C-5″′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12-13]基本一致，故鑒定化合物3為異夏佛塔苷（isoschaftoside）。

2.2.4 化合物4 化合物4為淡黃色無定形粉末，UV在波長270、335 nm處有最大吸收，HR-ESI-MS顯示m/z為577.157 3[M-H]-（計算值577.156 3），推測化合物的分子式為C27H30O14。二級質(zhì)譜給出1組診斷離子（m/z分別為297.077 8、325.073 0、353.067 9、383.078 8），說明該化合物具有芹菜素-6，8-C-二糖苷結(jié)構(gòu)[5]。碎片離子m/z473.110 6、457.115 7分別為母離子脫去1個C4H8O3和1個C4H8O4，說明結(jié)構(gòu)中存在1個葡萄糖基和1個鼠李糖基[5]。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.91（1H，s，加D2O后消失，5-OH），8.03（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.90（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.81（1H，s，H-3），5.05（1H，s，H-1″），4.73（1H，d，J＝9.9 Hz，H-1″′），1.26（3H，d，J＝5.2Hz，CH3-6″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：164.2（s，C-2），102.5（s，C-3），182.3（s，C-4），157.3（s，C-5），107.2（s，C-6），162.1（s，C-7），105.1（s，C-8），155.2（s，C-9），103.3（s，C-10），121.6（s，C-1′），129.1（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3′/5′），161.3（s，C-4′），74.5（s，C-1″），72.3（d，C-2″），74.2（d，C-3″），71.8（d，C-4″），77.4（d，C-5″），18.3（d，C-6″），73.4（d，C-1″′），70.9（d，C-2″′），78.8（d，C-3″′），70.7（d，C-4″′），82.0（d，C-5″′），61.5（d，C-6″′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14-15]的基本一致，故鑒定化合物4為異佛萊心苷（isoviolanthin）。

2.2.5 化合物5 化合物5為淡黃色無定形粉末，UV在波長270、335 nm處有最大吸收，HR-ESI-MS顯示m/z為577.156 8[M-H]-（計算值577.156 3），推測化合物的分子式為C27H30O14，可能為化合物4的同分異構(gòu)體。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.67（1H，s，加 D2O 后消失，5-OH），7.82（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2′/6′），6.91（各2H，d，J＝8.0 Hz，H-3′/5′），6.60（1H，s，H-3），4.77（1H，s，H-1″′），4.62（1H，d，J＝8.5 Hz，H-1″），1.14（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″′）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.1（s，C-2），102.6（d，C-3），181.9（s，C-4），161.1（s，C-5），109.2（s，C-6），161.1（s，C-7），102.6（s，C-8），152.9（s，C-9），102.6（s，C-10），121.4（s，C-1′），128.4（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3′/5′），160.1（s，C-4′），73.2（d，C-1″），70.1（d，C-2″），79.1（d，C-3″），70.8（d，C-4″），81.6（d，C-5″），61.5（d，C-6″），74.9（d，C-1″′），72.3（d，C-2″′），74.4（d，C-3″′），71.9（d，C-4″′），77.2（d，C-5″′），18.2（d，C-6″′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14，16]基本一致，故鑒定化合物5為佛萊心苷（violanthin）。

2.3 化合物1～5的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定實驗參考文獻[17]的方法。α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL）及其底物pNPG（1.0 mmol/L）、Na2CO3溶液（0.1 mol/L）均用PBS配制。反應(yīng)在96孔板中進行：取30 μL PBS，加入5 μL DMSO、10 μL α-葡萄糖苷酶和45 μL待測樣品[化合物1～5用DMSO溶解，加樣時用PBS稀釋；阿卡波糖（陽性對照）用超純水溶解，加樣時用PBS稀釋。給藥濃度均為1～500 μmol/L]，置于微孔板恒溫振蕩器中，于37℃條件下反應(yīng)10 min；然后加入10 μL pNPG，反應(yīng)15 min；加入45 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，混勻后，于405 nm波長下測定吸光度（A），每個待測樣品設(shè)置3個平行。按下列公式計算α-葡萄糖苷酶抑制率，并用Origin軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。α-葡萄糖苷酶抑制率（%）＝[1-（A樣品-A背景）/（A陰性-A空白）]×100%（式中，A樣品為酶、待測樣品和底物反應(yīng)后測得的A；A背景為上述過程只加待測樣品反應(yīng)后測得的A；A陰性為上述過程只加酶和底物反應(yīng)后測得的A；A空白為上述過程只加PBS反應(yīng)后測得的A）。結(jié)果顯示，化合物1～5和阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50分別為（1.79±1.27）、（2.05±0.72）、（1.93±0.67）、（1.09±0.46）、（1.36±0.58）、（18.69±1.24）μmol/L（n＝3）。

3 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床降低患者餐后血糖水平的常用藥物。然而，自阿卡波糖問世以來，迄今為止只有阿卡波糖等少數(shù)幾種α-葡萄糖苷酶抑制劑可用于臨床，從天然藥物中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑有望推動降血糖新藥研發(fā)[18]。本研究以α-葡萄糖苷酶活性為引導(dǎo)，從鐵皮石斛葉中分離得到5個芹菜素-6，8-C-二糖苷類成分，均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，系首次報告該類成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，芹菜素-6，8-C-二糖苷可能為鐵皮石斛葉降血糖活性成分，有望作為先導(dǎo)化合物進行降血糖藥物研究。本研究采用波譜學(xué)技術(shù)對化合物1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了解析，其中化合物1為新化合物，是首個同時具有鼠李糖和異鼠李糖取代的黃酮碳苷類成分，通過二維NMR譜和圓二色光譜確定了其立體構(gòu)型，并對其波譜數(shù)據(jù)進行了詳細歸屬；化合物2首次從該植物中分離得到。