邵駿菁，楊穎，馬大龍，呂志強(qiáng)，田景振，張曉平，4#（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 25055；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥品調(diào)劑科，山東 青島 266000；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東 青島 2662）

宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒引起，是一種會(huì)嚴(yán)重危害女性健康的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居全球第4位，且近年來呈年輕化的趨勢(shì)[2]。中醫(yī)藥在我國(guó)腫瘤患者的防治中發(fā)揮著重要作用，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤患者的診療過程都有中醫(yī)藥的參與[3-4]。中藥治療具有多途徑、多靶點(diǎn)、副作用小等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為臨床治療腫瘤不可或缺的手段之一[5-6]。

樺褐孔菌Inonotus obliquus為多孔菌科、褐臥孔菌屬的藥食兩用真菌，味微苦、性偏涼，以扶正為主，兼以祛邪，具有益氣養(yǎng)血、滋陰生津、疏肝解郁等作用[7-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明，樺褐孔菌具有良好的抗腫瘤、降血糖和降血脂等藥理活性，且尚未發(fā)現(xiàn)其明顯的不良反應(yīng)[10]。筆者前期已對(duì)樺褐孔菌的抗腫瘤譜和抗腫瘤活性部位進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)三萜類成分為其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效部位之一，且對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa具有良好的抑制效果，但作用機(jī)制尚不清晰[10]。此外還發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物中總?cè)坪枯^低?；诖?，本研究擬先對(duì)樺褐孔菌總?cè)七M(jìn)行純化，再對(duì)純化后的總?cè)七M(jìn)行抗腫瘤活性探討，為進(jìn)一步闡明樺褐孔菌抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV-6000型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），F(xiàn)A2014型十萬分之一電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），HF90型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），ULH100HG型熒光顯微鏡（日本Olmypus公司），Primaide型倒置顯微鏡（日本Hitachi公司），Epoch2T型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

樺褐孔菌藥材購(gòu)自神農(nóng)金康（湖南）原生態(tài)茶業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張曉平講師鑒定為真品。樺褐孔菌醇對(duì)照品（批號(hào)B50360，純度≥95%）和順鉑對(duì)照品（批號(hào)B24462，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂和X-5型大孔吸附樹脂（批號(hào)分別為A875381、X875377）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附樹脂（批號(hào)20200624）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MTT試劑（批號(hào)EZ6789C126）購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司；AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BMS500FI-100）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；AO/EB試劑盒（批號(hào)BB-4132-100T）購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）和二甲基亞砜（批號(hào)分別為21036449、EZ6789C15 0）均購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司。

1.3 細(xì)胞株

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購(gòu)自上海啟達(dá)生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锏闹苽?/h3>

經(jīng)過前期正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出樺褐孔菌總?cè)频淖罴烟崛」に嚾缦拢喝搴挚拙勰┻m量，置圓底燒瓶中，加12倍量（mL/g，下同）95%乙醇加熱回流2次，每次80 min，合并濾液，回收乙醇至無醇味，冷凍干燥得到樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛铮崛÷始s為2.136%。

2.2 樺褐孔菌總?cè)频暮繙y(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取樺褐孔菌醇對(duì)照品，加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取樺褐孔菌藥材粉末5 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法提取，冷凍干燥至50 mL，即得。

2.2.3 檢測(cè)方法 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液50 μL，置10 mL具塞試管中，100℃下水浴蒸干，加入0.2 mL新配制的香草醛-冰醋酸溶液（質(zhì)量濃度0.05 g/mL）和0.8 mL高氯酸，搖勻，70℃下水浴保溫反應(yīng)15 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯定容至5 mL，并利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)其在550 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2.2.4 方法學(xué)考察 按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）“分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，樺褐孔菌醇的回歸方程為Y＝0.058 9X-0.063 2（R2＝0.999 7）（式中Y為吸光度，X為待測(cè)物質(zhì)量濃度），線性范圍為3.20～17.60 μg/mL；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.71%、1.27%、0.89%（n＝6）；平均回收率為97.82%，RSD為2.35%（n＝6）?？疾旖Y(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2.2.5 樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锏暮繙y(cè)定 精密稱取“2.1”項(xiàng)下樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锓勰? mg，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度，再計(jì)算得樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛镏锌側(cè)频暮繛?4.36%。

2.3 樺褐孔菌總?cè)频募兓?/h3>

2.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 將大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，然后裝柱，用95%乙醇以5 mL/min的流速洗脫至洗脫液澄清，再用蒸餾水洗脫至無醇味即可。

2.3.2 大孔吸附樹脂種類的篩選 取預(yù)處理后的AB-8型、X-5型、D101型大孔吸附樹脂分為7組，分別為單用組、兩兩等比例混合的聯(lián)用組以及三者等比例混合的混用組，分別加至具塞錐形瓶中，各加入樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锶芤?0 mL（溶劑為水，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，總?cè)坪考s為0.687 mg/mL，下同），振蕩24 h（25℃、110 r/min，下同），過濾，取續(xù)濾液按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度。另將過濾后的大孔吸附樹脂加至具塞錐形瓶中，加乙醇20 mL，振蕩24 h，按上述方法計(jì)算其中總?cè)频馁|(zhì)量濃度。按下列公式計(jì)算吸附量、吸附率和解析率（表1）：吸附量＝V（c0-ce）/m，吸附率＝（c0-ce）/c0×100%，解析量＝V1c1/m，解析率＝V1c1/[V（c0-ce）]×100%，式中c0、ce、c1分別為樺褐孔菌總?cè)频募尤胭|(zhì)量濃度、平衡質(zhì)量濃度、解析后質(zhì)量濃度，V和V1分別為吸附液（樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锶芤海┘敖馕鲆海ㄒ掖迹w積，m為大孔吸附樹脂質(zhì)量。結(jié)果顯示，AB-8型大孔吸附樹脂的吸附量和吸附率最高，解析率僅略低于X-5型大孔吸附樹脂。綜合考慮，最終選用AB-8型大孔吸附樹脂純化樺褐孔菌總?cè)啤?/p>

表1 不同類型大孔吸附樹脂對(duì)樺褐孔菌總?cè)莆?、解析的影?/p>

2.3.3 靜態(tài)吸附曲線的繪制 精密稱取預(yù)處理后的AB-8型大孔吸附樹脂5 g（濕質(zhì)量，下同），置具塞錐形瓶中，加樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锶芤?0 mL，振蕩24 h進(jìn)行吸附，每小時(shí)測(cè)定溶液中樺褐孔菌總?cè)频暮?，并?jì)算吸附量和吸附率，繪制靜態(tài)吸附曲線（圖1）。圖1顯示，在吸附5 h后吸附量趨于平衡，最終吸附率為93.48%，表明AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)樺褐孔菌總?cè)凭哂休^好的吸附性能，在吸附5 h時(shí)基本達(dá)到吸附飽和。

圖1 AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)樺褐孔菌總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線

2.3.4 動(dòng)態(tài)吸附曲線的繪制 精密稱取預(yù)處理后的AB-8型大孔吸附樹脂25 g，平行7份，濕法裝柱（2.0 cm×30 cm，徑高比為2∶11），用2.0 mg/mL的樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锶芤荷蠘?，上樣速率?.0 mL/min，每流出20 mL流出液測(cè)定1次樺褐孔菌總?cè)频馁|(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線（圖2）。圖2顯示，第7份流出液中樺褐孔菌總?cè)瀑|(zhì)量濃度為0.063 75 mg/mL，接近初始上樣液質(zhì)量濃度的1/10，即認(rèn)為吸附飽和[11]，故選擇上樣體積為140 mL。

圖2 樺褐孔菌總?cè)圃贏B-8型大孔吸附樹脂中的動(dòng)態(tài)吸附曲線

2.3.5 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 同“2.3.4”項(xiàng)下方法裝柱，上樣速率為1.0 mL/min，上樣體積為140 mL，考察不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锷蠘尤芤簩?duì)吸附率的影響。結(jié)果顯示，上述上樣液的吸附率分別為98.61%、96.55%、95.63%、94.74%、89.38%、74.69%、65.82%，可見當(dāng)樺褐孔菌粗提物溶液的質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL時(shí)，吸附率均大于90%，考慮到生產(chǎn)周期和成本，最終選擇上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL。

2.3.6 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 同“2.3.4”項(xiàng)下方法裝柱，用2.0 mg/mL的樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锶芤荷蠘?，上樣體積為140 mL，考察不同上樣速率（1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min）對(duì)吸附率的影響。結(jié)果顯示，上述上樣速率下的吸附率分別為93.59%、90.52%、88.21%、84.68%，可見當(dāng)上樣速率為1.0 mL/min時(shí)，吸附率最高，最終選擇上樣流速為1.0 mL/min。

2.3.7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響 同“2.3.4”項(xiàng)下方法裝柱、上樣，吸附飽和后用200 mL的7種不同體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、75%、95%）的乙醇進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液中樺褐孔菌總?cè)频馁|(zhì)量濃度，按解析率公式計(jì)算洗脫率。結(jié)果顯示，上述體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液的洗脫率分別為15.27%、19.05%、33.40%、40.14%、57.77%、61.26%、98.16%，可見洗脫率和乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。以體積分?jǐn)?shù)＜50%的乙醇洗脫后經(jīng)濃縮凍干得到的固體呈深褐色，可見雜質(zhì)較多；體積分?jǐn)?shù)為60%和70%的乙醇洗脫率較低；以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇洗脫后經(jīng)濃縮凍干得到的固體呈淡黃色，且洗脫率最高。因此本實(shí)驗(yàn)最終確定先用50%的乙醇進(jìn)行洗脫，棄去非目標(biāo)部分，然后用95%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)部分。

2.3.8 洗脫劑用量對(duì)洗脫效果的影響 同“2.3.4”項(xiàng)下方法裝柱、上樣，吸附飽和后先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇以1.0 mL/min流速進(jìn)行洗脫，每流出20 mL洗脫液測(cè)定1次洗脫率，考察20～240 mL的95%乙醇對(duì)洗脫率的影響。結(jié)果顯示，第1～12份洗脫液的洗脫率分別為39.94%、15.35%、13.88%、6.42%、6.19%、4.05%、3.33%、2.97%、1.24%、1.09%、0.73%、0.62%，可見第9～12份洗脫液的洗脫率很低，且差異不大，表明此時(shí)大孔吸附樹脂吸附的總?cè)瞥煞忠驯怀浞窒疵?，故選擇洗脫劑用量為160 mL。

2.3.9 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響 同“2.3.4”項(xiàng)下方法裝柱、上樣，吸附飽和后先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL以不同流速進(jìn)行洗脫，考察1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速對(duì)洗脫率的影響。結(jié)果顯示，上述流速下的洗脫率分別為84.67%、87.49%、92.29%、70.12%，可見當(dāng)流速為3.0 mL/min時(shí)，洗脫率最高，故選擇流速為3.0 mL/min。

2.3.10 純化工藝驗(yàn)證 稱取同一批樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛?份，按照最佳純化工藝條件進(jìn)行純化，即選用AB-8型大孔吸附樹脂，上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣體積為140 mL，上樣流速為1.0 mL/min；洗脫時(shí)先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min，考察純化前后樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锏馁|(zhì)量和總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)（表2）。表2顯示，與純化前相比，總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高，純化后總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.05%（n＝3），說明本純化工藝合理、可行。

表2 樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锛兓尿?yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樺褐孔菌總?cè)萍兓锏捏w外抗腫瘤活性研究

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取樺褐孔菌總?cè)萍兓镞m量，置EP管中，加二甲基亞砜渦旋溶解，加RPMI1640細(xì)胞維持液稀釋至二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為0.1%，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.4.2 陽性對(duì)照藥物溶液的制備 精密稱取順鉑適量，置EP管中，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制成陽性對(duì)照藥物溶液，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。

2.4.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) HeLa細(xì)胞經(jīng)3次傳代后，用乙二胺四乙酸-0.25%胰酶消化至游離狀態(tài)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞液至1×106個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔80%時(shí)即可使用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、順鉑組和樺褐孔菌總?cè)平M。取上述供試品溶液和陽性對(duì)照藥物溶液，均二倍比稀釋制得8個(gè)梯度濃度，然后接種于細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上的96孔板中，培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。采用MTT染色法測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的光密度，計(jì)算得樺褐孔菌總?cè)萍兓锖晚樸K對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為184.20、20.10 μg/mL，可見樺褐孔菌總?cè)萍兓飳?duì)HeLa細(xì)胞具有一定的抑制作用。

2.4.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、順鉑組和樺褐孔菌總?cè)频汀⒅?、高劑量組，對(duì)照組細(xì)胞加入含2%胎牛血清和0.5%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，藥物組細(xì)胞加入含100、150、200 μg/mL供試品溶液（或20 μg/mL陽性對(duì)照藥物溶液）、2%胎牛血清和0.5%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用倒置顯微鏡分別記錄培養(yǎng)0 h和48 h的劃痕間距（圖3），使用Image J V1.53c軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率，并使用GraphPad 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，對(duì)照組、順鉑組和樺褐孔菌總?cè)频?、中、高劑量組的細(xì)胞遷移率分別為（43.04±1.60）%、（12.64±0.40）%、（26.99±0.73）%、（16.32±0.34）%、（9.78±0.41）%，RSD分別為3.71%、3.17%、2.72%、2.07%、4.22%（n＝3），可見細(xì)胞遷移率隨著樺褐孔菌總?cè)萍兓镔|(zhì)量濃度的升高而降低。與對(duì)照組相比，各藥物組的細(xì)胞遷移率均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 樺褐孔菌總?cè)萍兓飳?duì)HeLa細(xì)胞劃痕間距的影響（×40）

2.4.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) （1）采用AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。按“2.4.4”項(xiàng)下分組、加藥，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS清洗，重懸計(jì)數(shù)，參照AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞早期、晚期凋亡率（表3、圖4）。與對(duì)照組相比，各藥物組細(xì)胞的晚期凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。

圖4 樺褐孔菌總?cè)萍兓飳?duì)HeLa細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞圖

（2）采用AO/EB試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。按“2.4.4”項(xiàng)下分組、加藥，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS清洗，調(diào)整細(xì)胞在1×106個(gè)以內(nèi)，參照AO/EB試劑盒說明書操作，采用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果（圖5，綠色為正?；罴?xì)胞或早期凋亡細(xì)胞，橙紅色為晚期凋亡細(xì)胞），使用Image J V1.53c軟件進(jìn)行熒光定量計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（表3）。與對(duì)照組相比，各藥物組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 樺褐孔菌總?cè)茖?duì)HeLa細(xì)胞凋亡影響的熒光染色圖（×30）

表3 樺褐孔菌總?cè)萍兓飳?duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

目前樺褐孔菌總?cè)频募兓侄我源罂孜綐渲兓癁橹鱗12]。考慮到總?cè)祁惓煞謽O性較小，因此本實(shí)驗(yàn)篩選了AB-8型、D101型、X-5型3種極性較小的大孔吸附樹脂。通過對(duì)其吸附和解析能力進(jìn)行考察，最終選用AB-8型大孔吸附樹脂進(jìn)行樺褐孔菌總?cè)萍兓?。?jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)考察，篩選出最佳純化工藝為：AB-8型大孔吸附樹脂，上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣體積為140 mL，上樣流速為1.0 mL/min；洗脫時(shí)先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min。

筆者前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，三萜類成分是樺褐孔菌抗腫瘤的有效活性部位之一，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞HeLa、黑色素瘤細(xì)胞A375、胃癌細(xì)胞AGS、乳腺癌細(xì)胞T47D均具有良好的抑制效果，其中對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制效果最優(yōu)。因此本實(shí)驗(yàn)采用HeLa細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，觀察樺褐孔菌總?cè)萍兓锏目鼓[瘤活性。結(jié)果顯示，樺褐孔菌總?cè)萍兓锟梢种艸eLa細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡，主要促進(jìn)腫瘤細(xì)胞晚期凋亡。

綜上所述，本研究建立了樺褐孔菌總?cè)铺崛∥锏募兓に嚕浼兓锟梢种艸eLa細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡。但是其誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制尚不清楚，下一步仍需要深入研究。