王新寧，蘇艷艷，吳忠蘭，曹 慜，李龍山，裴建新，馬學(xué)平

(1. 寧夏疾病預(yù)防控制中心，寧夏 銀川 750003； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 3. 寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是嬰幼兒急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infection，ALRTI)和住院相關(guān)感染的主要病原體，5歲以下ALRTI死亡的兒童中約13%與之相關(guān)[1]。在老年人和免疫功能低下的成年人或既往有基礎(chǔ)疾病的患者中，HRSV感染的發(fā)病率和病死率更高[2]。HRSV每年導(dǎo)致全球約3 310萬(wàn)例下呼吸道感染，320萬(wàn)例住院，149.4萬(wàn)例5歲以下兒童死亡[3]，HRSV相關(guān)呼吸道感染是一個(gè)全球性的重大公共問(wèn)題。HRSV由10個(gè)基因構(gòu)成，至少可以編碼11種蛋白,包括9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(G、F、SH蛋白為RSV跨膜糖蛋白，N、P、L 3種蛋白相互作用構(gòu)成核衣殼蛋白，M、M2-1、M2-2為基質(zhì)蛋白)和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。HRSV只有1個(gè)血清學(xué)，根據(jù)其對(duì)單克隆抗體的反應(yīng)性、抗原性和遺傳特異性，將呼吸道合胞病毒(RSV)分為RSVA和RSVB兩個(gè)亞型，再根據(jù)G蛋白的第二高變區(qū)(the second hypervariable region in the G protein，HVR2)將HRSV-A劃分為18個(gè)基因型，分別為ON1～2、GA1～7、SAA1～2、NA1～4、TN1～2、CBA[4-7]，將HRSV-B劃分為39個(gè)基因型分別為GB1～13、BA1～14、BAc、URU1～2、SAB1～4、CB1(GB5)、CBB、BA-CCA、BA-CCB、THB[5,8-10]。本研究分析銀川市4株HRSV全基因組序列，研究其基因特征及氨基酸變異，以期為HRSV疾病防控及疫苗研制提供理論參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2021年銀川市2所流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的流感樣標(biāo)本共1 100份，選擇發(fā)熱伴有嚴(yán)重呼吸道感染癥狀的標(biāo)本共669份，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, real time RT-PCR)，篩選出HRSV陽(yáng)性標(biāo)本為后續(xù)二代測(cè)序做準(zhǔn)備,該研究的患者及其家屬均對(duì)此知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器及設(shè)備 碩世全自動(dòng)核酸提取儀及核酸快速提取試劑盒均購(gòu)自碩世生物科技股份有限公司，呼吸道6種病毒核酸檢測(cè)試劑盒(包括HRSV)購(gòu)自上海伯杰醫(yī)療有限公司，PCR擴(kuò)增儀(7500 Fast Real-Time PCR System、QuantStudioTM 7)均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 按照病毒核酸快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，取200 μL進(jìn)行病毒總RNA的提取。采用RT-PCR方法檢測(cè)6種呼吸道病毒核酸，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 基因測(cè)序 通過(guò)呼吸道病毒檢測(cè)，獲得HRSV陽(yáng)性標(biāo)本，篩選出HRSV CT值<25的標(biāo)本(CT值越小，病毒載量越高，二代全基因組測(cè)序成功率高)，取1 000 μL臨床標(biāo)本送至上海伯杰醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行合胞病毒二代全基因組測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析 使用MEGA7軟件進(jìn)行序列比對(duì)、親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和遺傳距離的計(jì)算分析，使用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，使用p-distance法估計(jì)遺傳距離，Bootstrap值均選擇1 000次引導(dǎo)重復(fù)測(cè)試準(zhǔn)確性。使用DNAStar軟件中MegAlign分析測(cè)序株與全球各代表株核苷酸和氨基酸序列的同源性。

1.6 全球代表株 在NCBI中搜索并下載HRSV的A亞型和B亞型代表株。由于B亞型全基因組序列代表株檢索出的代表株型別較少，故本研究選擇將G基因片段序列整理下載。其中全球38條HRSVA亞型代表株來(lái)自于12個(gè)國(guó)家，歷時(shí)36年(1984—2020年)，包括標(biāo)準(zhǔn)株A2株(M74568.1)，共有9種基因型別；全球35條HRSVB亞型代表株來(lái)自于16個(gè)國(guó)家，歷時(shí)27年(1993年—2020年)，包括標(biāo)準(zhǔn)株B1株(AF013254.1)，共有14種基因型別。

2 結(jié)果

2.1 HRSV陽(yáng)性情況 選擇的669份鼻咽拭子標(biāo)本，采用RT-PCR檢測(cè)6種呼吸道病毒核酸，獲得HRSV陽(yáng)性標(biāo)本共60份，陽(yáng)性率為8.97%。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 60份HRSV陽(yáng)性標(biāo)本中，CT值<25的HRSV的標(biāo)本共8份，進(jìn)行A、B亞型分型后，得到5株A亞型，3株B亞型。最終符合測(cè)序要求且測(cè)序成功共4株(2株HRSVA，2株HRSVB)，分別命名為YinChuanHRSVA-01、YinChuanHRSVA-02、YinChuanHRSVB-01、YinChuanHRSVB-02，長(zhǎng)度分別為15 180、15 176、15 209、15 217 bp。

將2株HRSVA亞型的測(cè)序結(jié)果與全球38條A亞型代表株進(jìn)行全基因組序列比對(duì)與分析，分別基于全基因組序列(圖1)、G蛋白基因組序列(圖2)、F蛋白基因組序列(圖3)構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)，在高變蛋白G基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上發(fā)現(xiàn)，銀川2株HRSVA均與ON1基因型代表株在同一分支上，因此判定為ON1型，且與在全序列、保守蛋白F基因的親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)上結(jié)論一致。通過(guò)對(duì)G蛋白基因全長(zhǎng)進(jìn)行遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，兩條銀川HRSVA間的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.001(0.003)，這兩條HRSVA與所有ON1型代表株的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.004～0.023(0.006～0.038)，YinChuanHRSVA-01、YinChuanHRSVA-02分別與標(biāo)準(zhǔn)株A2的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.100(0.157)、0.098(0.153)，YinChuanHRSVA-01、YinChuanHRSVA-02與GA1代表株(KJ723474.1)的核苷酸(氨基酸)遺傳距離最遠(yuǎn)，分別為0.125(0.181)、0.124(0.177)。

圖1 2條YinChuanHRSVA和38條全球代表株基于基因組全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖2 2條YinChuanHRSVA和38條全球代表株基于G蛋白基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 2條YinChuanHRSVA和38條全球代表株基于F蛋白基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

將2株HRSVB亞型的測(cè)序結(jié)果與全球35條B亞型代表株進(jìn)行G蛋白基因組序列比對(duì)與分析，基于G蛋白基因組序列構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4，在高變蛋白G基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上發(fā)現(xiàn)，銀川2株HRSVB均與BA9基因型代表株在同一分支上，判定為BA9型。分析G蛋白基因全長(zhǎng)遺傳距離發(fā)現(xiàn)，兩條銀川HRSVB間的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.002(0.003)，這兩條HRSVB與所有BA9型代表株的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.004～0.034(0.003～0.052)，YinChuanHRSVB-01、YinChuanHRSVB-02分別與標(biāo)準(zhǔn)株B1的核苷酸(氨基酸)遺傳距離為0.082(0.119)、0.082(0.122)，YinChuanRSVB-01、YinChuanHRSVB-02與GB1代表株(M73545)的核苷酸(氨基酸)遺傳距離最遠(yuǎn)，分別為0.085(0.158)、0.085(0.162)。

2.3 同源性分析 將銀川2條HRSVA序列與38條HRSVA亞型的全球代表株進(jìn)行全基因組序列、G蛋白基因組序列、F蛋白基因組序列核苷酸及氨基酸同源性分析。銀川2條HRSVA之間全序列、G蛋白基因、F蛋白基因的核苷酸(氨基酸)同源性分別為99.9%(92.3%)、99.9%(99.4%)、100%(99.8%)。將銀川2條HRSVA與各基因型別的平均核苷酸(氨基酸)同源性整理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀川2條HRSVA在全序列和主要蛋白基因(F、G)上，都與ON1基因型的平均核苷酸(氨基酸)同源性最高，與GA1基因型的平均核苷酸(氨基酸)同源性最低。銀川2條HRSVA全長(zhǎng)序列與MN306029.1/USA/2019/ON1全長(zhǎng)序列的核苷酸(氨基酸)最高，均為99.3%(91.2%)，與KJ723474/USA/1989/GA1最低。見(jiàn)表1。

表1 YinChuanHRSVA與不同基因型代表株主要蛋白基因的核苷酸及氨基酸同源性分析

將銀川2條HRSVB與35條HRSVB亞型的全球代表株進(jìn)行G蛋白基因組序列核苷酸及氨基酸同源性分析(見(jiàn)圖5、6)，銀川2條HRSVB之間G蛋白基因序列的核苷酸(氨基酸)同源性為99.2%(98.4%)，YinChuanHRSVB-01、YinChuanHRSVB-02序列均與MW160815.1/Australia/2017/BA9的G蛋白基因序列核苷酸(氨基酸)同源性最高，分別為97.8%(96.6%)、97.8%(96.3%),均與JX908836.1/Brazil/2007/GB3的核苷酸(氨基酸)同源性最低，分別為67.4%(65.4%)、67.4%(65.1%)。

圖5 YinChuanHRSVB與不同基因型代表株核苷酸同源性分析

圖6 YinChuanHRSVB與不同基因型代表株氨基酸同源性分析

2.4 氨基酸變異分析 與HRSVA原型株M11486株的G蛋白氨基酸序列比較，加拿大首株ON1型(JN257693.1)、YinChuanHRSVA-01、YinChuanHRSVA-02均插入了24個(gè)重復(fù)氨基酸(第285～307位)，終止密碼子均是TGA。與加拿大首株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖7)，銀川2條HRSVA在第113、131、178、257、258、266位均發(fā)生了突變，分別為T113I、V131D、N178G、E257K、H258Q、H266L，YinChuanHRSVA-01在第134位發(fā)生K突變?yōu)镽(K134R)。

圖7 HRSVA-ON1型G蛋白氨基酸序列比較

與HRSVB原型株CH-18537株的G蛋白氨基酸序列比較，BA型代表株(AY333364.1)、YinChuanHRSVA-01、YinChuanHRSVA-02均插入了20個(gè)重復(fù)氨基酸(第260—279位)，與BA型代表株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖8)，銀川2條HRSVB的終止密碼子為TAA，在第159位和第160位均出現(xiàn)氨基酸缺失，在G蛋白第二高變區(qū)的第254、270、276、290位均發(fā)生T突變?yōu)镮(T254I、T270I、T276I、T290I)。

圖8 HRSVB-BA9型G蛋白氨基酸序列比較

3 討論

HRSV是導(dǎo)致嬰幼兒和免疫缺陷人群出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸道感染的主要原因，所有年齡段的人群感染后都會(huì)出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，如輕微的上呼吸道感染、嚴(yán)重的肺炎或細(xì)支氣管炎[11-12]。HRSV的流行情況因地而異。本研究中人群HRSV陽(yáng)性率為8.97%，與研究對(duì)象為全人群相關(guān)研究相比，HRSV陽(yáng)性率低于北京市(15.30%)[13]，高于西安市(4.51%)[14]、白銀市(4.08%)[15]。HRSV導(dǎo)致的呼吸道感染癥狀與新型冠狀病毒肺炎的癥狀相似，且HRSV的陽(yáng)性率高，對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情的日常防控造成了影響。目前，尚無(wú)針對(duì)HRSV治療有效的臨床方案和安全有效的疫苗，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。加強(qiáng)對(duì)HRSV的分子流行病學(xué)及基因特征分析，能為臨床診斷和疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。G蛋白(glycoprotein，黏附蛋白)和F蛋白(fusion protein，融合蛋白)是HRSV的主要表面糖蛋白，F(xiàn)蛋白基因序列在亞型間更保守，激發(fā)的中和抗體具有更廣譜的保護(hù)作用，是HRSV預(yù)防及治療性抗體、藥物及疫苗開(kāi)發(fā)的重要靶標(biāo)，G蛋白基因在病毒與宿主細(xì)胞間的黏附和穿膜入胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的吸附過(guò)程，G蛋白表面的B及T細(xì)胞抗原表位，能激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答并且產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，由于G蛋白的遺傳多樣性，其相應(yīng)的中和抗體大多沒(méi)有廣泛保護(hù)作用，也反映了G蛋白具有強(qiáng)大的免疫壓力，因此研究G和F蛋白基因序列，對(duì)疫苗研制也至關(guān)重要。本研究對(duì)HRSVA亞型的全基因組、G和F蛋白基因，以及HRSVB的G蛋白基因分別構(gòu)建了親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)及核苷酸(氨基酸)同源性分析，結(jié)果顯示，兩條銀川HRSVA均屬于ON1型，且均與美國(guó)(MN306029.1/USA/2019/ON1)基因全長(zhǎng)序列同源性最高，兩條銀川HRSVB都均屬于BA9型，且與澳大利亞(MW160815.1/Australia/2017/BA9)的G蛋白基因序列同源性最高。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上還發(fā)現(xiàn)，基因型一致的序列更多的是通過(guò)時(shí)間(年份)聚集在一分支上，而不是地點(diǎn)聚集在一起，表明HRSV基因型在全球范圍內(nèi)快速傳播的。

BA型于1999年首次在阿根廷報(bào)道，其特點(diǎn)是在B亞型G基因C-末端中插入了60個(gè)重復(fù)氨基酸序列，ON1型于2010年首次在加拿大報(bào)道，其特點(diǎn)是在A亞型G基因C-末端插入72個(gè)重復(fù)核苷酸序列。通過(guò)氨基酸變異分析發(fā)現(xiàn)，2條序列是ON1型，2條序列為BA型。此4條G蛋白氨基酸的突變主要集中在第一高變區(qū)和第二高變區(qū)，銀川市ON1型的5個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(T113I、V131D、N178G、H258Q、H266L)與廣州報(bào)道[16]的ON1型變異位點(diǎn)一致。銀川市BA型6個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(K218T、L223P、S247P、T270I、I281T、H287Y)與沙特阿拉伯報(bào)道[17]的BA型變異位點(diǎn)一致，同時(shí)各地區(qū)出現(xiàn)不同的氨基酸變異位點(diǎn)，說(shuō)明該病毒的變異位點(diǎn)存在地區(qū)特異性，應(yīng)將相同變異位點(diǎn)與地區(qū)特異性變異位點(diǎn)相結(jié)合，研發(fā)出廣泛適用于全國(guó)各地人群的疫苗。Liang等[18]對(duì)蘭州HRSV的進(jìn)化推測(cè)顯示，過(guò)去GA2取代GA5成為優(yōu)勢(shì)基因型用時(shí)7年，HRSVB亞型中BA基因型取代非BA基因型用時(shí)5年，而ON1僅僅不到2年就完全取代NA1基因型。因此，在未來(lái)十年或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，BA基因型的傳播有可能被ON1取代。

因地域和年份不同HRSV在流行中呈現(xiàn)出不同的變化，可表現(xiàn)為HRSVA、HRSVB亞型交替流行，即以其中一種亞型為主要流行亞型，也可以表現(xiàn)為HRSVA、HRSVB亞型同時(shí)為主要流行亞型。目前全球的流行亞型為HRSV-A中的ON1型和HRSV-B中的BA9型。本研究顯示，2021年銀川市HRSV出現(xiàn)了HRSVA和HRSVB共流行的情況。不足之處：本研究未對(duì)所有HRSV陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行A、B亞型分型，也未對(duì)RSVA和RSVB進(jìn)一步分型。尚不能確定2021年銀川市HRSV主要流行的優(yōu)勢(shì)基因型。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。