朱玉潔 朱濤 盛潔 周琪 蔣中英?

1) (伊犁師范大學(xué)電子與工程學(xué)院,微納電傳感技術(shù)與仿生器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,伊寧 835000)

2) (南京大學(xué)物理學(xué)院,固體微結(jié)構(gòu)物理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210093)

磷脂相分離是細(xì)胞脂質(zhì)筏形成的物理驅(qū)動(dòng)力,在生命物質(zhì)的空間組裝中發(fā)揮著重要的作用.本研究通過單微疇跟蹤、徑向波動(dòng)性分析等手段定量地研究了多組分磷脂相分離動(dòng)力學(xué).發(fā)現(xiàn)在低線張力差異下,大相的黏滯性是產(chǎn)生微疇粗化差異的主要原因.融合產(chǎn)生的流場促進(jìn)微疇擴(kuò)散,加速了低黏滯大相中微疇的融合粗化;而高黏滯大相中微疇主要依賴布朗運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散,融合粗化較慢.進(jìn)一步建立微疇的擴(kuò)散與融合粗化理論模型,理解了大相黏滯性較高與較低時(shí),微疇尺寸與粗化時(shí)間分別滿足的0.5 與1 冪指數(shù)關(guān)系.此外還發(fā)現(xiàn),可以通過膽固醇相對(duì)含量調(diào)節(jié)大相黏滯性,提高了微疇粗化的可控性.研究深化了多組分磷脂相分離機(jī)制的理解,為調(diào)控細(xì)胞膜表面的生物分子再分布提供了有價(jià)值的參考.

1 引言

細(xì)胞膜表面的生物分子空間組裝對(duì)生命功能至關(guān)重要.在二維的細(xì)胞膜中,脂質(zhì)筏將不同性質(zhì)的磷脂和蛋白分子在側(cè)向分揀成高有序并相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(富飽和磷脂與膽固醇)[1,2].在信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白輸運(yùn)等諸多涉及膜內(nèi)分子組裝的過程中,脂質(zhì)筏發(fā)揮了高效濃縮特異性分子的作用[3-5].

研究發(fā)現(xiàn),可以通過磷脂間相互作用引起側(cè)向組分相分離,形成與脂質(zhì)筏組分相近的結(jié)構(gòu)[6].因此,多組分巨單層囊泡(GUVs)被用于研究脂質(zhì)筏的物理化學(xué)性質(zhì).研究發(fā)現(xiàn),相分離的熱力學(xué)性質(zhì)(如相分離的形成條件及穩(wěn)定性)由一系列實(shí)驗(yàn)參量(如溫度[7,8]、混合磷脂比例[9]等)決定.在高溫下,磷脂的混合熵較高,GUVs 形成單一的液相;降溫導(dǎo)致熵降低,不同磷脂間的焓作用差異導(dǎo)致GUVs 形成排布有序和無序的相分離結(jié)構(gòu)[7].

由于細(xì)胞不是一個(gè)封閉的熱力學(xué)平衡體系[10],研究多組分GUVs 相分離的形成動(dòng)力學(xué)對(duì)理解脂質(zhì)筏的動(dòng)態(tài)組裝與調(diào)控是至關(guān)重要的[11].國內(nèi)外眾多課題組立足生物分子組裝開展了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)與理論研究[12,13].Stanich 等[14]報(bào)道,降溫導(dǎo)致GUVs表面形成了許多納米尺度的微小圓形微疇.微疇可通過兩種機(jī)制粗化: 一是融合粗化,即微疇通過擴(kuò)散與周邊的微疇碰撞、融合形成更大的微疇;二是蒸發(fā)-凝聚粗化,磷脂從較小的微疇邊界蒸發(fā)并結(jié)合到更大的微疇邊界.并且,微疇的粗化動(dòng)力學(xué)受到多種因素的影響.Garcia-Saez 等[15]發(fā)現(xiàn),不同組分間的線張力驅(qū)動(dòng)著微疇的粗化,以降低微疇的總邊長.提高線張力可顯著加快微疇的粗化.Rozovsky 等[16]發(fā)現(xiàn),在線張力的驅(qū)動(dòng)下,過量膜面積可誘導(dǎo)產(chǎn)生微疇出芽.芽頸的膜曲率產(chǎn)生微疇間的近程排斥,使得融合粗化動(dòng)力學(xué)受阻.Li 等[17]進(jìn)一步給出,當(dāng)線張力超過臨界值,芽結(jié)構(gòu)可與母體完全分裂.增大自發(fā)曲率可降低該臨界線張力值,并提高微疇分裂的頻率.此外,降溫速率控制的成核點(diǎn)數(shù)量等也會(huì)影響微疇的粗化動(dòng)力學(xué)[14].但以上研究往往聚焦較高線張力下的微疇粗化動(dòng)力學(xué).在細(xì)胞脂質(zhì)筏涉及的低線張力條件下,相分離的產(chǎn)生及其影響機(jī)制尚待深入研究.

最近一些課題組將單微疇表征策略應(yīng)用于微疇粗化與組裝研究.Talbot 等[18]采用激光共聚焦顯微三維(3D)重構(gòu)了單個(gè)微疇在溫度梯度場中的運(yùn)動(dòng),發(fā)現(xiàn)了線張力梯度引起的異常微疇超擴(kuò)散,給出了微疇種類無關(guān)的、在高溫側(cè)融合粗化的內(nèi)在機(jī)制.Wongsirojkul 等[19]采用寬場熒光顯微追蹤了單個(gè)微疇的徑向波動(dòng),發(fā)現(xiàn)了膜張力產(chǎn)生的高線張力,給出了組分依賴的、低滲條件下磷脂膜相分離機(jī)制.通過單微疇的軌跡跟蹤、徑向波動(dòng)分析等,可以定量地給出線張力、側(cè)向擴(kuò)散等膜性質(zhì),從而為磷脂相分離研究提供重要的分析數(shù)據(jù).

本文采用單微疇表征策略研究了類細(xì)胞脂筏的產(chǎn)生與調(diào)控.研究采用了較高的實(shí)驗(yàn)溫度以產(chǎn)生較低的線張力;選擇了4 個(gè)線張力差異較低的組分,考察了它們的微疇粗化動(dòng)力學(xué).發(fā)現(xiàn)可以通過大相黏滯性調(diào)控微疇的尺寸.給出了不同黏滯性下的微疇擴(kuò)散與粗化機(jī)制差異,獲得了大相黏滯性決定的微疇尺寸與時(shí)間標(biāo)度關(guān)系.并發(fā)現(xiàn)可以通過膽固醇調(diào)控大相黏滯性,闡明了膽固醇相對(duì)含量反向影響液態(tài)有序、無序相黏滯性的機(jī)制.

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 電方法制備巨型單層囊泡(GUVs)

采用電形成方法制備GUVs[20].二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、膽固醇(Chol)和1,2-二油酰-SN-甘油—3-磷酰乙醇胺(Rhod-PE)購于Avanti Polar Lipids 公司.一般地,將給定組分的磷脂溶于氯仿中,摻雜摩爾分?jǐn)?shù)為0.5% 的Rhod-PE.取6 μL 磷脂溶液涂抹至ITO 玻璃導(dǎo)電面(電阻率為 5×10-4Ω·cm),真空干燥2 h.在兩塊ITO 玻璃中夾放0.3 mm 硅膠墊片形成GUVs 制備艙室.將300 mmol/L 蔗糖溶液緩慢注入艙內(nèi).施加峰峰值5 V、頻率10 Hz 的正弦交流電,溫度設(shè)置為60 ℃培養(yǎng)3 h 獲得GUVs.

2.2 熒光顯微鏡表征三組分磷脂相分離及相圖

采用Olympus IX7 倒置熒光顯微鏡(配置Andor 897 EMCCD、532 nm 激光光源、100×油鏡)觀察GUVs 表面的磷脂相分離.選用的GUVs直徑在20—50 μm,將GUVs 靜置于兩片玻片之間硅膠涂制的艙室里.在觀測前,電形成的GUVs被稀釋于295 mmol/L 葡萄糖溶液中.GUVs 內(nèi)部的滲透壓略高于外部,低正張力膜可消除過量的膜面積,并且內(nèi)外溶液密度差使GUVs 沉淀至物鏡側(cè)玻片表面以便于觀測[21].GUVs 溫度通過Warner顯微鏡熱臺(tái)進(jìn)行控制(控溫精度0.1 ℃).一般地,從42 ℃ (混溶性轉(zhuǎn)變溫度以上)快速降溫至32 ℃(混溶性轉(zhuǎn)變溫度以下)以形成磷脂相分離結(jié)構(gòu)(—10 °C/min),并在溫度穩(wěn)定在32 °C 后再進(jìn)行顯微鏡觀測.微疇的平均半徑(r)通過灰度閾值確定的面積計(jì)算獲得.統(tǒng)計(jì)使用的微疇中心處于GUVs中3/10 囊泡直徑劃定的圓形范圍內(nèi),以降低二維投影分析產(chǎn)生的誤差.微疇的面密度通過觀測半球的微疇數(shù)量除以半球表面積獲得.實(shí)驗(yàn)獲得的DOPC/DPPC/Chol 三組分相圖與之前報(bào)道的結(jié)果一致[22].基于三組分相圖的等溫連結(jié)線,獲取了液態(tài)有序(Lo)與液態(tài)無序(Ld)疇中的磷脂組分.在相圖中繪制Lo與Ld面積相同的組分連線,等溫連結(jié)線近似于該線的垂線.等溫連結(jié)線與Lo-Ld相分離相區(qū)邊界的交點(diǎn)即為大相與微疇的組分.

2.3 線張力分析

線張力通過分析微疇的徑向波動(dòng)性獲得[19].具體地,在溫度降至32 ℃約5 min 后,采集數(shù)次約5 s 時(shí)長的微疇邊界波動(dòng)(6 幀/s).邊界偏離半徑的譜線以傅里葉級(jí)數(shù)展開的形式給出:

其中,ψ為相位角,k為波數(shù),ak與bk為幅值.過剩自由能滿足:

其中λ為線張力.根據(jù)能量均分定律,每個(gè)獨(dú)立波數(shù)的自由能均為kBT[19].其中,kB為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對(duì)溫度.因此,

線張力通過(3)式擬合微疇邊界波動(dòng)數(shù)據(jù)獲得.選擇較大GUVs (直徑≥40 μm)中心的微疇用于線張力的計(jì)算.用于線張力分析的微疇僅受到微量的低強(qiáng)度激光輻照(總輻照時(shí)間短于10 s),以減小光氧化造成的線張力偏移.

2.4 微疇均方位移及側(cè)向擴(kuò)散速率分析

采集微疇的運(yùn)動(dòng)軌跡以分析其均方位移及側(cè)向擴(kuò)散速率[23].具體地,在溫度降至32 ℃后約2—10 min 內(nèi),熒光顯微采集約1 min 時(shí)長的微疇運(yùn)動(dòng)(6 幀/s).通過ImageJ 的TrackMate 模塊重構(gòu)微疇的擴(kuò)散軌跡,以微疇中心在t時(shí)刻各方向的位移(x(t),y(t))計(jì)算均方位移(MSD(t)):

符合布朗擴(kuò)散的微疇MSD(t)與t滿足線性關(guān)系[24]:

其中D為側(cè)向擴(kuò)散速率.用于均方位移及側(cè)向擴(kuò)散速率分析的微疇滿足以下要求: 1) 微疇的中心處于GUVs 中0.7 倍囊泡直徑劃定的圓形范圍內(nèi),用以降低二維模型分析產(chǎn)生的誤差[25];2) 微疇近圓形,其邊緣到中心的距離處于0.85r—1.15r范圍內(nèi).

2.5 膜黏滯性的熒光光譜分析

通過二苯基己三烯(DPH)熒光的各向異性表征磷脂膜的黏滯性[26].制備摻雜摩爾分?jǐn)?shù)為0.5%DPH 給定組分的GUVs,使用Perkin Elmer LS55 熒光分光光度計(jì)獲取發(fā)射光強(qiáng).激發(fā)光波長設(shè)為360 nm,發(fā)射光波長設(shè)為430 nm.樣品溫度通過PTP1 溫控組件(Perkin Elmer)恒定在32 ℃.DPH 的各向異性(a)使用下式計(jì)算:

其中,I0和I90分別為平行、垂直于平面偏振激發(fā)光的發(fā)射光光強(qiáng)分量.a反映了磷脂膜的黏滯性.a越低則磷脂膜的黏滯性越低.

3 結(jié)果與討論

首先,獲取了DOPC/DPPC/Chol 三組分在32 ℃的相圖(見圖1(a)).在相圖中的灰色區(qū)域,GUVs 形成液態(tài)有序(Lo)-液態(tài)無序(Ld)相分離.Lo相主要由分子排布較為緊密的DPPC 與Chol構(gòu)成,而Ld相主要由分子排布較為疏松的DOPC構(gòu)成[7].熒光染料Rhod-PE 選擇性地混溶入Ld相[27],在532 nm 的激發(fā)下發(fā)出明亮的熒光.相圖中的紅色點(diǎn)線表示Lo與Ld面積相同的組分.在該點(diǎn)線的左側(cè),Lo微疇分散在Ld大相之中(如DOPC/DPPC/Chol 的摩爾百分比為27%/53%/20%,40%/40%/20%,分別簡稱為M1,M2).而在該線的右側(cè),Ld微疇分散在Lo大相中(如DOPC/DPPC/Chol 的摩爾百分比為11%/44%/45%,16%/64%/20%,分別簡稱為M3,M4).點(diǎn)線的垂直線近似為等溫連結(jié)線[7].基于等溫連結(jié)線與相區(qū)邊界的交點(diǎn),可獲取大相與微疇的磷脂含量比例(表1).

表1 微疇與大相的混合磷脂含量Table 1.Lipid composition in domains and bulks.

圖1 DOPC/DPPC/Chol 三組分相分離 (a) 32 °C 的相圖,紅色點(diǎn)線表示Lo 與Ld 面積相同的組分,標(biāo)尺為 10 μm;(b) 微疇尺寸分布圖;(c) 微疇面密度分布圖Fig.1.Phase diagram for vesicles of DOPC/DPPC/Chol:(a) Phase diagram at 32 °C.Red dotted line denotes the composition whose Lo and Ld phases occupy the same surface area.Scale bar is 10 μm.(b) Size distribution of the domains.(c) Surface density of the domains.

圖1(a)給出了降溫5 min 的M1—M4 的GUVs顯微圖像.采用微疇面積、觀測半球的微疇數(shù)量(＞28 囊泡/組分)獲取了微疇半徑(r)及面密度,發(fā)現(xiàn)不同組分的相分離微疇尺寸、數(shù)量存在顯著差異.M1—M3 的微疇半徑(r)較大,面密度較低;而M4 的微疇尺寸較小,面密度較高.圖1(b)和圖1(c)給出了微疇尺寸與面密度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.M1—M3 微疇的平均半徑分別是M4 的4.7,3.2,2.0 倍,但面密度是后者的10.1%,19.8%,30.0%.這表明前三個(gè)組分微疇更迅速地粗化.需要指出,在較高線張力條件下,微疇可出芽以降低其與大相的接觸邊長[8,16].但圖1(a)中未觀測到明顯的出芽結(jié)構(gòu).低線張力(見下文)與低滲正膜張力抑制了膜曲率的產(chǎn)生.最終微疇完全融合形成兩個(gè)完全分離的Lo-Ld大疇結(jié)構(gòu).

GUVs 微疇的時(shí)間演變(圖2(a)和圖2(b))表明微疇的融合次數(shù)具有組分依賴性.圖2(c)對(duì)降溫2.5—4.0 min 內(nèi)單位膜面積內(nèi)的融合次數(shù)(n)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì).此時(shí)微疇的半徑主要分布在0.4—10.5 μm 之間,能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行個(gè)體采集與分析.發(fā)現(xiàn)融合次數(shù)符合nM1＞nM2＞nM3＞nM4,其中M1 在統(tǒng)計(jì)時(shí)段內(nèi)的融合次數(shù)是M4 的19 倍,表明微疇融合的差異可能是造成不同組分微疇粗化差異的重要原因.而對(duì)融合與未融合微疇尺寸演變的統(tǒng)計(jì)(圖2(d))表明,通過蒸發(fā)-凝聚方式的粗化是可以忽略的.這與之前報(bào)道的融合粗化主導(dǎo)了Lo-Ld相分離中微疇的粗化一致[7].線張力(λ)是微疇融合粗化的主要驅(qū)動(dòng)力,反映了不同磷脂組分相溶性的差異[9,15].為考察實(shí)驗(yàn)中觀測到的粗化差異是否由線張力產(chǎn)生,通過微疇的徑向波動(dòng)性分析了M1 —M4 的線張力(圖3(a)).圖3(b)給出了徑向波動(dòng)性譜線,圖3(c)給出了對(duì)應(yīng)傅里葉級(jí)數(shù)展開的波數(shù)和系數(shù),通過(3)式對(duì)此數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合獲得線張力(圖3(d)).發(fā)現(xiàn)線張力符合λM1＞λM4＞λM2＞λM3,所有組分的平均線張力都處于同一量級(jí)(0.1 pN).0.1 pN 量級(jí)被認(rèn)為是微疇尺寸由納米向微米轉(zhuǎn)變的臨界線張力[28].低于該量級(jí),微疇受熱擾動(dòng)無法融合為顯微鏡可見的相分離.更為重要的是,線張力與粗化微疇尺寸(圖1(b))的大小排序并不一致.Garcia-Saez 等[15]通過改變磷脂尾鏈長度產(chǎn)生了跨3 個(gè)量級(jí)的線張力,發(fā)現(xiàn)微疇的平均面積粗化率與線張力成正比.但在我們的研究中,由于所有組分的線張力均處于同一量級(jí),其他因素可能在相疇融合粗化中發(fā)揮了重要作用.

圖2 微疇的粗化 (a) M1 和(b) M4 的微疇融合粗化.部分典型微疇的擴(kuò)散和融合被標(biāo)記出來.其中綠色圓環(huán)表示發(fā)生融合,紅色箭頭表示相鄰時(shí)刻間微疇的擴(kuò)散方向.(c) 2.5—4.0 min 中M1—M4 單位膜面積的融合次數(shù).(d) 微疇的尺寸演變.微疇Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ融合生成微疇Ⅵ,產(chǎn)生了顯著的微疇粗化.而未發(fā)生融合的微疇Ⅰ尺寸沒有發(fā)生變化.標(biāo)尺為10 μmFig.2.Coarsening of domains.Coarsening by coalescence of domains in (a) M1 and (b) M4.The diffusion and coalescence of some typical domains are marked.The green circles denote the coalescence.The red arrows denote the diffusion direction of domains between the adjacent images.(c) Number of coalescences in unit surface area between 2.5—4.0 min.(d) Time evolution of domain size.Coarsening of domains is produced by the coalescence of the domains Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ to form domain Ⅵ.Size of the domain Ⅰ remains unchanged without coalescence.Scale bar is 10 μm.

圖3 基于微疇徑向波動(dòng)性計(jì)算的線張力 (a) M1—M4 微疇的熒光顯微圖;(b) 微疇極角(θ)對(duì)應(yīng)的徑向波動(dòng)性;(c) 由傅里葉級(jí)數(shù)展開的波數(shù)(k)和系數(shù)(ak,bk)計(jì)算的 與 1/(k2-1) 關(guān)系;(d) 磷脂組分依賴的線張力Fig.3.Line tension calculated by domain boundary fluctuation: (a) Fluorescence microscopy of domains in M1-M4;(b) radial fluctuation as a function of polar angle (θ);(c) relationship between and 1/(k2-1) calculated from the Fourier coefficients (ak,bk) and mode number (k);(d) dependence of line tension on lipid composition.

在微疇的融合粗化中,微疇需要經(jīng)歷擴(kuò)散碰撞才能實(shí)現(xiàn)融合.進(jìn)一步考察了微疇在膜內(nèi)的擴(kuò)散動(dòng)力學(xué).圖4(a)和圖4(b)給出了微疇的代表性運(yùn)動(dòng)軌跡.在考察的GUVs 中,M3 與M4 的微疇基本符合布朗運(yùn)動(dòng),而M1 與M2 有大量微疇在部分時(shí)段不符合布朗運(yùn)動(dòng).布朗運(yùn)動(dòng)微疇的均方位移(MSD)和時(shí)間呈線性關(guān)系(圖4(a)藍(lán)線,(5)式);而非布朗運(yùn)動(dòng)微疇的MSD 呈指數(shù)型增長(圖4(a)紅線).微疇的非布朗運(yùn)動(dòng)源于Liang 等[27]報(bào)道的融合促進(jìn)的微疇擴(kuò)散,即微疇融合時(shí)產(chǎn)生的磷脂層流場誘導(dǎo)了周邊微疇的擴(kuò)散.Yanagisawa 等[29]將其簡化為微疇間吸引.圖4(b)給出了一個(gè)融合促進(jìn)微疇擴(kuò)散的軌跡: 在周邊微疇Ⅰ和Ⅱ融合前,微疇Ⅲ呈布朗運(yùn)動(dòng)(藍(lán)色軌跡);微疇Ⅰ和Ⅱ融合后,微疇Ⅲ迅速向Ⅰ,Ⅱ方向遷移(紅色軌跡).更多的融合促進(jìn)的微疇運(yùn)動(dòng)見圖2(a).需要指出,流場的動(dòng)能是由微疇融合造成的線張力降低提供的.流場速率(v)為v～σ/η[27],其中σ=λ/h2～10-7N/m2(h為微疇與大相的厚度差)[15],η為大相黏滯系數(shù).由v的表達(dá)式可得,降低大相黏滯性可顯著提高流場速率.在M1 和M2 組分實(shí)驗(yàn)中,觀測到較為顯著的非布朗運(yùn)動(dòng)微疇,即強(qiáng)流場影響,表明M1 和M2的大相黏滯性可能比M3 和M4 低.

圖4 微疇在膜內(nèi)的擴(kuò)散 (a) 典型的運(yùn)動(dòng)軌跡與MSD,紅、藍(lán)色分別標(biāo)記了布朗運(yùn)動(dòng)與非布朗運(yùn)動(dòng).(b) 融合促進(jìn)的微疇擴(kuò)散,在微疇Ⅰ和Ⅱ融合前,微疇Ⅲ呈布朗運(yùn)動(dòng)(藍(lán)色軌跡);在微疇Ⅰ和Ⅱ融合后,微疇Ⅲ以近線性軌跡(紅色)向Ⅰ,Ⅱ方向遷移.微疇Ⅲ在833 ms 內(nèi)擴(kuò)散遷移了約3 μm (右圖).(c) 基于布朗運(yùn)動(dòng)的微疇統(tǒng)計(jì)獲得的擴(kuò)散速率-微疇尺寸關(guān)系.標(biāo)尺為10 μmFig.4.Diffusion of domains in lipid membranes: (a) Typical trajectories and MSD.Brownian and non-Brownian motions are marked by blue and red colors.(b) Coalescence-induced domain diffusion.Before the coalescence of domains Ⅰ and Ⅱ,domain Ⅲunderwent Brownian motion (blue trajectory).After the coalescence,domain Ⅲ diffused to Ⅰ and Ⅱ through a nearly straight line(red trajectory).The diffusion distance of domain Ⅲ is around 3 μm in 833 ms (images at right).(c) Plot of diffusion coefficient versus domain size obtained from the Brownian motion of the domains.Scale bar is 10 μm.

基于符合布朗運(yùn)動(dòng)微疇的均方位移,估算了影響微疇擴(kuò)散的重要參量η.首先,采用(5)式計(jì)算布朗運(yùn)動(dòng)微疇的側(cè)向擴(kuò)散速率D(圖4(c)).發(fā)現(xiàn)對(duì)于相近尺寸的微疇,在Ld大相的擴(kuò)散速率高于Lo大相.這源于不同相態(tài)磷脂膜自由體積含量的差異[30].磷脂層中側(cè)向擴(kuò)散的本質(zhì)是磷脂分子不斷占據(jù)可用自由體積的過程[31].Lo相磷脂排布相對(duì)有序,自由體積含量較低,因此其中內(nèi)含物的擴(kuò)散較慢.與之相對(duì),Ld相磷脂排布的相對(duì)無序產(chǎn)生了較快的側(cè)向擴(kuò)散.隨后,基于Petrov 和Schwille 等[32]構(gòu)建的Hughes-Pailthorpe-White (HPW)經(jīng)驗(yàn)關(guān)系式數(shù)值求解大相的黏滯系數(shù):

其中ε=2rηm/η,ηm為溶液黏滯系數(shù);γ為歐拉常數(shù);c1,c2,b1,b2為常數(shù).獲得的η值如圖5(a)所示.可以看出,Lo大相的黏滯系數(shù)在10—8—10—7Pa·s·m,Ld大相的黏滯系數(shù)在10—9Pa·s·m (圖5(a)),這與表面剪切流變實(shí)驗(yàn)報(bào)道的磷脂膜黏滯性范圍是一致的[33].并且黏滯系數(shù)符合ηM4＞ηM3＞ηM2＞ηM1(圖5(a)).M4 的黏滯系數(shù)比M1 高兩個(gè)量級(jí).圖5(b)給出了大相黏滯系數(shù)與對(duì)應(yīng)微疇尺寸(降溫5 min)的關(guān)系,兩者的同向變化說明了兩者的內(nèi)在相關(guān)性.下文將半定量地討論大相黏滯性與微疇粗化的關(guān)系.

圖5 大相的黏滯性 (a) 數(shù)值求解的大相黏滯系數(shù);(b) 大相黏滯系數(shù)與降溫5.0 min 的M1 —M4 的微疇尺寸Fig.5.Bulk viscosity: (a) Numerically computed bulk viscosity;(b) plot of the bulk viscosity versus domain size in M1-M4 (5.0 min after the temperature quench).

首先討論產(chǎn)生ηM4＞ηM3＞ηM2＞ηM1的原因.膽固醇可能顯著影響了大相磷脂的密排結(jié)構(gòu),從而改變了大相的黏滯性[31,34].通過DPH 熒光光譜實(shí)驗(yàn)考察了膽固醇含量對(duì)膜黏滯性的影響.DPH 的擺動(dòng)影響了發(fā)射光各向異性,反映著周邊磷脂雙層疏水內(nèi)核的黏滯性[26].如圖6(a)所示,單組分DOPC和DPPC 膜分別具有DPH 各向異性(a)的最低值與最高值,對(duì)應(yīng)著它們所處的液相(Lα)、凝膠相(Lβ)的極低與極高黏滯性(～10-10Pa·s·m[34],～10-6Pa·s·m[35]).Chol 的加入引起了a的變化.對(duì)于DOPC/Chol 膜,a隨著Chol 含量的提高而增大,表明Chol 使得Lα相磷脂膜的黏滯性提高.而對(duì)于DPPC/Chol 膜,Chol 含量的提高降低了a,表明Chol 降低了Lβ相磷脂膜的黏滯性.基于以上結(jié)果,給出Chol 影響多組分GUVs 中大相黏滯性的機(jī)制示意圖(圖6(b)).當(dāng)Lo大相中的Chol與DPPC 含量之比提高時(shí)(Chol/DPPCM4=0.29,Chol/DPPCM3=0.97),性質(zhì)更偏離DPPC 的Lβ相,導(dǎo)致ηM3＜ηM4.當(dāng)Ld大相中的Chol 與DOPC含量之比提高時(shí)(Chol/DOPCM1=0.17,Chol/DOPCM2=0.27),膜性質(zhì)更偏離DOPC 的Lα相,導(dǎo)致ηM2＞ηM1.以上結(jié)果表明,可通過改變膽固醇的相對(duì)含量調(diào)節(jié)大相黏滯性,從而間接影響磷脂膜的相分離動(dòng)力學(xué).

圖6 Chol 影響的磷脂膜黏滯性 (a) 摻雜DPH 的DPPC/Chol 與 DOPC/Chol 組分GUVs 的熒光光譜與各向異性(32 °C);(b) 黏滯性變化對(duì)應(yīng)的分子排布示意圖.磷脂排布有序度的提高造成膜黏滯性提高[34]Fig.6.Membrane viscosity influenced by Chol: (a) Fluorescence spectrum and anisotropy of DPH-doped DPPC/Chol and DOPC/Chol GUVs (32 °C);(b) schematic illustration for the molecular packing associated with the different membrane viscosity.The increase of the packing order increases the viscosity[34].

進(jìn)一步考察大相黏滯性與微疇粗化率間的關(guān)系.實(shí)驗(yàn)中降溫迅速完成(1.0 min),以消減二次微疇成核造成的尺寸波動(dòng).圖7 在對(duì)數(shù)坐標(biāo)系中給出了歸一化的微疇的平均半徑與時(shí)間關(guān)系.發(fā)現(xiàn)所有組分的微疇均滿足r=tα.但大相黏滯性低實(shí)驗(yàn)擬合的α值 (αM1=0.96,αM2=0.93)顯著高于大相黏滯性高實(shí)驗(yàn)的擬合值 (αM3=0.52,αM4=0.50).相近地,Liang 等[27]在微疇融合誘導(dǎo)的擴(kuò)散體系中觀測到α～1,Tayebi 等[36]在高黏滯的吸附磷脂多層體系中觀測到α～0.5 .為理解大相黏滯性相關(guān)的微疇粗化標(biāo)度律,假設(shè)大相中均勻分布著許多尺寸相同的微疇.當(dāng)微疇尺寸較小時(shí),微疇面密度較高導(dǎo)致它們間距較低;但當(dāng)微疇融合粗化至較大尺寸時(shí),微疇密度降低導(dǎo)致它們間距提高.因此,微疇的半徑r(t)近似與微疇的間距l(xiāng)(t) 成正比.當(dāng)大相黏滯性較高時(shí),微疇需要以布朗運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散l(t)的距離與周邊微疇接觸融合,即l(t)2∝Dt.由于r(t)∝l(t),因此r(t)2∝Dt.代入HPW 的Saffman-Delbrück 簡化式[25]:D=(需滿足η＞ηmr,實(shí)驗(yàn)條件下的估算值見表2),忽略對(duì)數(shù)項(xiàng)近似得到:

圖7 大相黏滯性依賴的微疇尺寸與時(shí)間標(biāo)度律.r 與t被歸一化以方便比較(下標(biāo)0 代表初始時(shí)刻)Fig.7.Bulk viscosity-depended scaling relation between domain size and time.r and t are normalized for comparison of the data (the subscript 0 denotes the initial).

(8)式與高黏滯的M3 和M4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近.而當(dāng)大相黏滯性較低時(shí),微疇融合引起的流場可促進(jìn)周邊微疇的靠攏.微疇間融合的時(shí)間tf近似為tf∝l(t)/v.微疇尺寸的增長滿足 dr(t)/dt=.而由于r(t)∝l(t),可得

(9)式與低黏滯的M1 和M2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近.因此,高低黏滯性下不同的微疇尺寸-時(shí)間標(biāo)度律是由不同的微疇擴(kuò)散機(jī)制引起的.需要指出,以上α值與早些無膜張力體系中觀測到的α≤1/3 具有區(qū)別.較小的α值可能源于膜形變等因素[37,38].低滲正膜張力實(shí)驗(yàn)條件抑制了膜的形變與熱波動(dòng),從而促進(jìn)了相分離的進(jìn)行[19].綜上所述,在線張力較低的多組分磷脂相分離中,大相黏滯性可在微疇的粗化動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用.

深入理解GUVs 微疇的粗化機(jī)制對(duì)深入理解脂質(zhì)筏動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要.我們的研究給出了大相黏滯性引起的微疇擴(kuò)散與粗化機(jī)制.但研究尚未給出高/低黏滯性的準(zhǔn)確分界值.ηmr可能是重要的參考量(表2).當(dāng)η＜ηmr,周圍水媒介與磷脂層的動(dòng)量交換是可忽略的.而當(dāng)η＞ηmr,微疇融合產(chǎn)生的流場可能將動(dòng)能顯著地耗散于周邊水媒介,從而降低其對(duì)微疇擴(kuò)散的影響.之后的研究將對(duì)該分界值進(jìn)行深入探索.

表2 實(shí)驗(yàn)條件下 η 與 ηmr 的估算值(降溫后2.5—4.0 min)Table 2.Estimated values of η and ηmr at the experiments (2.5-4.0 min after the temperature quench).

4 結(jié)論

本文通過單微疇跟蹤、徑向波動(dòng)性分析等手段定量地研究了微疇的粗化動(dòng)力學(xué).發(fā)現(xiàn)當(dāng)大相黏滯性較低,微疇融合產(chǎn)生的流場促進(jìn)了微疇擴(kuò)散,加速了微疇融合粗化;當(dāng)大相黏滯性較高,微疇通過布朗運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散,融合粗化較慢.在兩種情況下,分別滿足r(t)∝t0.5與r(t)∝t1的微疇粗化標(biāo)度律.此外,大相黏滯性可由膽固醇的相對(duì)含量調(diào)節(jié),變化的方向具有大相種類依賴性.研究深化了多組分磷脂相分離機(jī)制的理解,為考察細(xì)胞脂質(zhì)筏的動(dòng)態(tài)行為、調(diào)控膜表面的分子組裝提供了參考.

感謝南京大學(xué)物理學(xué)院向雅心博士關(guān)于理論建模的討論.