李 欣 陸東哲 張懿中 吳朝暉 李 昂 王曉熙 薛 迪 周 萍

與一般的生物制品不同，干細(xì)胞來源于活的生物體組織，其生產(chǎn)制備過程包括干細(xì)胞采集、組織分離、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與純化、細(xì)胞擴(kuò)增、凍存、運(yùn)輸?shù)葟?fù)雜程序。確保細(xì)胞活性、生物功能穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性和質(zhì)量可控性，關(guān)系到干細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性和有效性[1]。本文通過系統(tǒng)性綜述，分析不同類型干細(xì)胞(主要是間充質(zhì)干細(xì)胞)制備過程中的倫理問題，為干細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)的質(zhì)量控制、干細(xì)胞產(chǎn)品臨床應(yīng)用的安全性評(píng)估和干細(xì)胞生產(chǎn)制備技術(shù)的不斷完善提供參考依據(jù)。

1 資料來源

本研究通過國(guó)內(nèi)外的6個(gè)主要文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國(guó)知網(wǎng)、萬方、PubMed、Ovid-EMBASE、Cochrane Library)的相關(guān)文獻(xiàn)檢索，根據(jù)文獻(xiàn)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，獲得2010年1月～2020年7月發(fā)表的涉及干細(xì)胞制備倫理風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)文獻(xiàn)。具體文獻(xiàn)篩選過程見《干細(xì)胞生物材料來源及其倫理風(fēng)險(xiǎn)的系統(tǒng)性綜述》一文[2]。

2 結(jié)果

2.1 涉及干細(xì)胞制備過程中倫理風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)分析

64篇納入分析的涉及干細(xì)胞制備過程中倫理風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)中，發(fā)表文獻(xiàn)較多的年份為2011年～2015年，占所有文獻(xiàn)的64.06%；第一作者所在國(guó)家主要來自中國(guó)(占89.06%)；文獻(xiàn)類型主要是評(píng)述或一般綜述類(占59.37%)，原始研究和學(xué)位論文均占17.19%。見表1～表3。

表1 干細(xì)胞制備過程中倫理風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)發(fā)表年份

表2 干細(xì)胞制備過程中倫理風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)作者國(guó)別

表3 干細(xì)胞制備過程中倫理風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)類型

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞制備過程中的倫理問題

2.2.1 供者和組織來源的選擇

不同供者來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其增長(zhǎng)率、分化能力、染色體穩(wěn)定性、植入機(jī)體后的活性等有所差異。一般來說，供者年齡較大的MSCs老化較快，其生物學(xué)活性也會(huì)變差，從而使誘導(dǎo)成功率降低，如隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓數(shù)量顯著減少，MSCs的增殖及分化能力變?nèi)鮗3]。不同細(xì)胞來源和培養(yǎng)方式，細(xì)胞攜帶傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)和傳染的后果不同。供者攜帶隱性遺傳病的異常染色體，由于其缺乏可供檢測(cè)的細(xì)胞表型，增加了受者引入相關(guān)遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。此外，不同組織源性的MSCs受特定基因表達(dá)的影響，其表面特征和功能也會(huì)有所不同，有必要根據(jù)其組織來源進(jìn)行選擇[5]。

2.2.2 鑒定、分離、純化

目前，MSCs鑒定、分離、純化的難度仍較大，而難以找到特異性的表面標(biāo)記使MSCs鑒定困難。MSCs分離方法有多種，包括貼壁培養(yǎng)法、免疫磁珠法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法等，每種方法都有不足之處。如貼壁培養(yǎng)法獲得的MSCs純度不夠高，免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法價(jià)格高昂，且會(huì)損傷細(xì)胞而影響存活率。因此，MSCs分離需要多種方法結(jié)合使用。MSCs的定向分化對(duì)分化微環(huán)境有嚴(yán)格要求，但有時(shí)取自供者不同組織的MSCs不能分化為目標(biāo)細(xì)胞(targeted cells)而分化為其他細(xì)胞，可控性不夠高[5]。MSCs的鑒定、分離、純化問題對(duì)干細(xì)胞制備過程中的安全性和效果構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

2.2.3 添加物使用

MSCs培養(yǎng)過程中需要使用血清、抗生素、誘導(dǎo)劑等添加物，這些可能成為MSCs體外培養(yǎng)過程中外源性污染的來源。胎牛血清屬異種蛋白，可能含有動(dòng)物攜帶的細(xì)菌、病毒、感染性蛋白質(zhì)、朊病毒、生長(zhǎng)因子及多種成分不明的促細(xì)胞分化因子，且不同批次間的胎牛血清高度變異，組成成分尚不十分清楚。針對(duì)胎牛血清存在的諸多弊端，越來越多的研究開始探索使用無動(dòng)物性成分的添加劑(如血小板裂解液、富血小板血漿、人血清、人臍血清等)替代胎牛血清，但這些添加劑也存在缺陷，如血液來源有限、血小板裂解液擴(kuò)增的MSCs在臨床應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)劑方面具有局限性、人血清中可能含有病原體等[6]。

干細(xì)胞制劑在應(yīng)用之前需要冷藏，而常用的冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜具有潛在的毒性，特別在高于4℃的溫度下，可致基因型改變、分化潛能受損，對(duì)受者產(chǎn)生副作用(如惡心、嘔吐，甚至死亡)[7-8]。

2.2.4 永生化、表型改變和致瘤性問題

干細(xì)胞的多次傳代會(huì)使干細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，如老化、多向分化潛能退化、分泌能力降低，甚至出現(xiàn)永生化傾向或癌變能力。如隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，骨髓MSCs表面標(biāo)志物逐漸丟失，第9代已檢測(cè)不到標(biāo)志物；也有發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs長(zhǎng)期體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，可能突破壽命調(diào)控而呈現(xiàn)出永生化傾向[9]。MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代后，可能出現(xiàn)染色體變異，雖然目前尚未證實(shí)染色體的異常改變與致瘤性相關(guān)，但這種改變提示了培養(yǎng)環(huán)境可導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性的發(fā)生，遺傳不穩(wěn)定性則是細(xì)胞癌變的重要生物學(xué)基礎(chǔ)之一[10]。臍帶MSCs也可能存在異常的染色體核型。此外，經(jīng)體外培養(yǎng)的MSCs在特定的微環(huán)境下(如低氧、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)、生物因素等)可能發(fā)生惡變，生物因素會(huì)影響MSCs的增殖、分化和促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化[5]。

MSCs的致瘤性仍存在諸多爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為MSCs移植前進(jìn)行了廣泛的體外擴(kuò)增增加了基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化；但是也有學(xué)者認(rèn)為體外擴(kuò)增出現(xiàn)的惡變是由于在實(shí)驗(yàn)室中使用的細(xì)胞株的交叉污染導(dǎo)致[11]。

2.3 人胚胎干細(xì)胞制備過程中的倫理問題

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)制備過程的倫理問題包括：(1)衍生過程中使用動(dòng)物培養(yǎng)基或滋養(yǎng)細(xì)胞(feeder cells)成分有傳播感染和異種抗原的風(fēng)險(xiǎn)；(2)經(jīng)體外培養(yǎng)后，容易發(fā)生遺傳和表觀遺傳性狀的改變，也觀察到一些印跡基因的表達(dá)發(fā)生改變[12]，還可能發(fā)生染色體拷貝數(shù)的改變及雜合丟失[10]；(3)在培養(yǎng)中可能表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性和無法預(yù)判的分化結(jié)果，導(dǎo)致下一代出現(xiàn)某些生理缺陷；(4)疾病不能通過植入前遺傳診斷識(shí)別，因此僅能建立罕見的單基因突變或單染色體畸變的疾病特異性hESCs；(5)hESCs的定向誘導(dǎo)分化仍存在挑戰(zhàn)，不同的hESCs發(fā)育潛力不同；(6)由hESCs分化得來的多巴胺能神經(jīng)元可能存在質(zhì)量問題；(7)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)是影響hESCs和人孤雌胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性的首要因素。

2.4 其他干細(xì)胞制備過程中的倫理問題

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是神經(jīng)外胚層細(xì)胞系的多能干細(xì)胞，形成過程中可能出現(xiàn)細(xì)胞變異，包括突變、表觀遺傳重組異常、X染色體失活、拷貝數(shù)異常、DNA堿基的改變、出現(xiàn)免疫原性等[13]。

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的增殖能力較強(qiáng)，具有多向分化潛能，但是脂肪組織中含量有限，并且在制備過程中也存在一些亟待解決的問題。如ADSCs缺乏特異性的表面標(biāo)志物，分離純化困難；定向多向分化的機(jī)制目前尚不清楚，體內(nèi)外誘導(dǎo)機(jī)制還未成熟和完善[14]；ADSCs長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的安全性問題仍未獲得準(zhǔn)確評(píng)估和保障，可能引發(fā)自發(fā)的惡性轉(zhuǎn)化[15]。

骨髓干細(xì)胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)是重要的肝外肝細(xì)胞來源，但是BMSCs分化過程存在癌變和促纖維化的風(fēng)險(xiǎn)，且BMSCs向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程非常緩慢[16]。

近年來，精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)的研究也取得一定的突破，但是SSCs數(shù)量極少，組織來源有限，若患者缺乏SSCs，則難以獲取SSCs用于治療不育；SSCs穩(wěn)定性低，且各批次間差異大，不具備高重復(fù)性，因此SSCs富集和保存難度均較大；針對(duì)SSCs表面標(biāo)志物和分化抗原特征的研究仍未取得進(jìn)展，因而獲得高純度的SSCs十分困難。雖然目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人SSCs的體外增殖培養(yǎng)，但培養(yǎng)難度較大，SSCs在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中會(huì)發(fā)生表型改變，并且尚未實(shí)現(xiàn)人SSCs在體外誘導(dǎo)分化形成精子，離臨床應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)[17]。

3 討論

3.1 人類對(duì)干細(xì)胞制備過程的認(rèn)識(shí)尚處在發(fā)展階段

現(xiàn)階段，干細(xì)胞制備過程仍存在許多亟待完善的方面。不同供者來源的干細(xì)胞分化能力、生物學(xué)活性、老化速度等存在較大差異，因此在制備過程中應(yīng)該嚴(yán)格選擇干細(xì)胞來源生物材料的供者，特別是供者需進(jìn)行嚴(yán)格體檢，充分了解供者遺傳背景和既往病史，確定是否有遺傳病以及健康狀況是否符合要求等，盡量排除可能對(duì)干細(xì)胞受者產(chǎn)生不良影響的因素，如人體免疫缺陷病毒、人類T淋巴細(xì)胞病毒等[5]。干細(xì)胞的制備技術(shù)尚未成熟，干細(xì)胞的鑒定、分離、純化仍存在很大挑戰(zhàn)，非目的性分化、無功能性分化、不能有效擴(kuò)增等問題亟待解決，體內(nèi)外誘導(dǎo)機(jī)制仍未完善，這些都阻礙了干細(xì)胞臨床應(yīng)用的進(jìn)展。

3.2 制備安全性是臨床應(yīng)用倫理關(guān)注的重要方面

干細(xì)胞制備的安全性問題涉及多個(gè)方面，包括外源性微生物污染、異種蛋白引入；批次之間產(chǎn)品的穩(wěn)定性差；多次傳代后干細(xì)胞的生物學(xué)特性改變，出現(xiàn)老化、多向分化潛能退化、分泌能力降低，甚至出現(xiàn)永生化傾向；經(jīng)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)還會(huì)出現(xiàn)染色體變異，特定的微環(huán)境也可能影響干細(xì)胞的增殖、分化和促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化等。干細(xì)胞制備的安全性是影響干細(xì)胞大規(guī)模臨床應(yīng)用的重要原因，也是干細(xì)胞臨床應(yīng)用倫理關(guān)注的重要方面。

3.3 干細(xì)胞制備過程需嚴(yán)格控制質(zhì)量，不斷改進(jìn)工藝

不同于傳統(tǒng)的藥物，干細(xì)胞制劑的制備技術(shù)具有多樣性、復(fù)雜性和特殊性。為了確保干細(xì)胞制劑臨床應(yīng)用的安全性和有效性，需要對(duì)干細(xì)胞的采集和分離、干細(xì)胞系的建立、干細(xì)胞制劑制備的整個(gè)過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控[18]。此外，還需繼續(xù)改進(jìn)制備工藝，盡可能使用無動(dòng)物源性成分的添加物或使用無血清的培養(yǎng)基，減少添加物殘留量，降低微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)；在干細(xì)胞產(chǎn)品用于臨床治療之前，對(duì)長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增過程中的干細(xì)胞進(jìn)行安全性評(píng)估，了解基因組及表觀遺傳穩(wěn)定性的相關(guān)因子是否發(fā)生變化，確保人體移植的安全性。