賈麗君，單煜，戴偉，汪丞禮，姚霏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 a.藥劑科，b.急診科，江蘇蘇州 215000)

原發(fā)性肝癌是全球第六大癌癥，也是世界范圍內(nèi)第二大與死亡相關(guān)的腫瘤疾病，近年來世界各地的發(fā)病率和死亡率都有所增加，我國亦是肝癌的高發(fā)地區(qū)。臨床在治療肝癌中發(fā)現(xiàn)，腫瘤本身對于放化療不敏感，根據(jù)這樣的特性，肝癌可以通過手術(shù)切除、肝移植、肝臟定向治療和全身治療進(jìn)行干預(yù)。但是超過70%的患者在診斷時(shí)，肝癌已經(jīng)發(fā)展為中晚期，不再適合進(jìn)行手術(shù)治療或肝臟移植，因此全身治療(免疫療法)研究的開展日益迫切。中醫(yī)認(rèn)為肝癌的病機(jī)以脾虛為主，數(shù)據(jù)發(fā)掘中醫(yī)臨床用藥治療肝癌的宏觀規(guī)律發(fā)現(xiàn)補(bǔ)虛藥使用頻次最高，治療應(yīng)以益氣健脾為基本治則。參芪五味子由南五味子、黨參、黃芪、炒酸棗仁構(gòu)成，擁有健脾益氣、寧心安神的功效，與中醫(yī)辨證肝癌的基本治則相符。臨床上也用于輔助治療腫瘤，可增加患者機(jī)體免疫功能、保護(hù)造血功能，與化療藥聯(lián)用可降低副作用，穩(wěn)定化療效果。另外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)組成參芪五味子的4味中藥均有不同程度的抗腫瘤效應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。因此，從肝癌基本治則和單味藥有效角度推測參芪五味子有一定的抗肝癌效應(yīng)，本研究圍繞參芪五味子在免疫中的作用，分析其對肝癌荷瘤小鼠機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的影響，為其應(yīng)用于臨床抗肝癌治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

昆明小鼠(SPF級(jí)，雄性，體重22～25 g)40只購買于蘇州愛爾麥特科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]。本研究由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

肝癌H22細(xì)胞株由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院贈(zèng)予。

參芪五味子顆粒(SQW，批號(hào)2107241301)購自康縣獨(dú)一味生物制藥有限公司；注射用順鉑(DDP，凍干型，批號(hào)AA1A8028B)購買于齊魯制藥有限公司。

PRMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購買于Gibco公司；Anti-Mouse CD3e、Anti-Mouse CD4、Anti-Mouse CD8a、Anti-Mouse CD19、Anti-Mouse NK1.1、小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒，均購買于eBioscience公司；Mouse TNF-α ELISA Kit 購買于杭州聯(lián)科生物；Accuri C6型流式細(xì)胞儀購買于BD公司。

(1)造模。取生長狀況良好，對數(shù)期的H22細(xì)胞接種于4只小鼠腹腔，待小鼠腹部腫脹，約10天時(shí)抽取腹水瘤液，按密度稀釋至10個(gè)/mL，0.2 mL/只接種在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d的健康的昆明小鼠右側(cè)腋窩皮下，觀察成瘤情況，8～10天腫瘤長至直徑約1 cm認(rèn)為模型建立。(2)分組與給藥。隨機(jī)將成瘤小鼠分成模型組，陽性藥順鉑5 mg/kg組，參芪五味子顆粒5.35 g/kg低劑量組、10.7 g/kg中劑量組、21.4 g/kg高劑量組，每組8只，用生理鹽水配制。模型組(給予等量生理鹽水)、參芪五味子顆粒組灌胃給藥2周，每天1次；陽性藥順鉑組腹腔注射，3天1次，給藥2周?？刂颇[瘤生長大小，測量腫瘤直徑以評(píng)估腫瘤對于小鼠的負(fù)擔(dān)，當(dāng)腫瘤重量達(dá)到實(shí)驗(yàn)小鼠體重的10%以上時(shí)，通過頸椎脫位處死小鼠。(3)樣本收集與檢測。在第14天最后一次給藥后禁食12 h，處死小鼠，收集胸腺、脾臟和腫瘤，并稱量與記錄。抑瘤率=(模型對照組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量)/模型對照組平均腫瘤重量×100%。臟器指數(shù)=(臟器平均重量/小鼠平均體重)×100%。(4)免疫熒光標(biāo)記法檢測脾臟免疫細(xì)胞。收集經(jīng)碾磨、過篩、紅細(xì)胞裂解后的脾淋巴單個(gè)細(xì)胞懸液，加入流式抗體(用各種熒光素標(biāo)記)，在4 ℃下避光孵育30 min，洗去多余的未結(jié)合的抗體，用Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測。(5)ELISA法檢測血清TNF-α。收集荷瘤小鼠全血，靜置30 min，3000 r/min離心10 min取上清，檢測操作按說明書。

2 結(jié) 果

在昆明種小鼠皮下接種2×10個(gè)腹水瘤液細(xì)胞，建立小鼠異位肝癌移植瘤模型。從第9天開始，用參芪五味子顆粒以5.35 g/kg、10.7 g/kg和21.4 g/kg口服灌胃給小鼠治療2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型對照組腫瘤重量比較，給予參芪五味子顆粒治療后的小鼠腫瘤重量減輕：模型對照組腫瘤重量為(0.95±0.26)g，參芪五味子顆粒低、中、高三個(gè)劑量組腫瘤重量分別為(0.81±0.24)g、(0.75±0.10)g和(0.61±0.06g)，見圖1A。參芪五味子顆粒低、中、高三個(gè)劑量組抑瘤率分別為14.56%、21.00%和36.09%，其抑瘤效應(yīng)遠(yuǎn)低于陽性藥順鉑組(79.82%)，見圖1B。提示參芪五味子顆粒對H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤有一定的抑制生長的作用。

A. 各組腫瘤重量, B. 各組抑瘤率。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 參芪五味子顆粒對肝癌荷瘤小鼠腫瘤的影響

為了確定參芪五味子顆粒對肝癌荷瘤小鼠免疫器官的影響，我們對小鼠胸腺和脾臟重量進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷瘤小鼠給予參芪五味子顆粒前后體重沒有明顯變化。與模型對照組脾臟重量(0.14±0.03)g比較發(fā)現(xiàn)，參芪五味子顆粒低、中、高三個(gè)劑量組脾臟重量分別為(0.19±0.02)g、(0.24±0.03)g和(0.23±0.03)g，重量顯著增加(<0.05)；但是各組胸腺重量沒有明顯變化。根據(jù)公式計(jì)算臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，由于荷瘤小鼠體重未有明顯變化，參芪五味子顆粒組脾臟重量增加，脾臟指數(shù)亦顯著增加(<0.05)，胸腺指數(shù)無影響，見圖2。給予化療藥順鉑治療組的荷瘤小鼠，體重下降為(18.00±0.79)g；胸腺縮小到(0.003±0.001)g；脾臟亦顯著變小，重量僅為(0.02±0.01)g；脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)亦顯著性降低，提示順鉑對荷瘤小鼠的免疫器官有明顯的損害作用。但是參芪五味子顆粒對荷瘤小鼠免疫器官?zèng)]有毒性作用，具有保護(hù)作用，具體體現(xiàn)在對脾臟有明顯的增重效應(yīng)。

A.各組脾臟重量、胸腺重量和荷瘤小鼠體重,B.各組脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 參芪五味子顆粒對肝癌荷瘤小鼠免疫器官的影響

我們通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析經(jīng)參芪五味子顆粒治療的小鼠肝癌模型中的脾淋巴細(xì)胞亞群，CD3CD8代表激活的T細(xì)胞，CD19代表B細(xì)胞。與模型對照組比較，參芪五味子顆粒組脾臟中的CD3CD8(圖3A)、CD19陽性細(xì)胞百分比(圖3B)顯著增加，尤其中高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。順鉑顯著降低荷瘤小鼠的脾淋巴CD3CD8、CD19陽性細(xì)胞百分比，進(jìn)一步提示順鉑對荷瘤小鼠免疫器官的損傷作用，而參芪五味子顆粒治療可以提高荷瘤小鼠脾臟中CD8T細(xì)胞和CD19B細(xì)胞的比例，激活細(xì)胞免疫和非特異性免疫抗肝癌作用。

A.各組T細(xì)胞百分比, B.各組B細(xì)胞百分比。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 參芪五味子顆粒對肝癌荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響

T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性反應(yīng)在抗腫瘤細(xì)胞中起著重要作用，為了進(jìn)一步說明參芪五味子顆粒對腫瘤免疫反應(yīng)的影響，我們通過流式細(xì)胞術(shù)研究其對肝癌荷瘤小鼠脾臟中自然殺傷T(NKT)細(xì)胞的影響。NKT細(xì)胞在肝癌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，我們用CD3CD4NK1.1代表活化的NKT細(xì)胞。與模型對照組比較，參芪五味子顆粒組脾臟中的CD3CD4NK1.1陽性NKT細(xì)胞百分比顯著增加，呈一定劑量依賴性(圖4A，<0.05)。CD4CD25Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)對抗腫瘤免疫反應(yīng)具有抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與模型對照組比較，參芪五味子顆粒組脾臟中的CD4CD25Foxp3陽性Treg細(xì)胞百分比呈微弱的下降趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。荷瘤小鼠經(jīng)參芪五味子顆粒治療后血清中TNF-α水平隨劑量增加而升高(圖4C，<0.05)。陽性藥順鉑組與模型對照組比較，NKT和CD4CD25Foxp3陽性百分比均下降，血清中TNF-α水平減少，再次提示順鉑的免疫毒性作用。

A.各組NKT細(xì)胞百分比, B.各組Treg細(xì)胞百分比, C.各組血清中TNF-α含量。與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 參芪五味子顆粒促進(jìn)肝癌荷瘤小鼠T細(xì)胞的激活

3 討 論

免疫系統(tǒng)在保護(hù)宿主免受腫瘤侵襲方面起著至關(guān)重要的作用。近年來肝癌的免疫治療相對熱門，研究手段主要有免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療(通過阻斷免疫檢查點(diǎn)或其配體的方式阻斷免疫抑制信號(hào)向T細(xì)胞傳遞，如PD-1/PD-L1阻斷劑)、腫瘤疫苗接種(將腫瘤抗原引入患者體內(nèi)以增強(qiáng)抗原識(shí)別度，喚醒患者的免疫系統(tǒng)，克服免疫抑制狀態(tài)，最終達(dá)到抗腫瘤的目的，如核酸疫苗)和過繼細(xì)胞治療(分離腫瘤患者體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞，修飾這些免疫細(xì)胞或用某些細(xì)胞因子刺激它們，這些免疫細(xì)胞在體外被擴(kuò)增和篩選，然后返回給患者，如CIK細(xì)胞)，這些方法對肝癌有一定的治療作用，但仍需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床研究驗(yàn)證。中藥方劑治療在臨床上用于改善腫瘤患者生活質(zhì)量，緩解化療藥帶來的副作用，具有一定的優(yōu)越性。本研究發(fā)現(xiàn)參芪五味子顆粒對肝癌有微弱的抑制作用(高劑量21.4 g/kg組的抑瘤率僅為36.09%)，該效應(yīng)推測是由于荷瘤小鼠給予參芪五味子顆粒治療使得免疫器官重量增加，進(jìn)而激活H22荷瘤小鼠脾臟中的T細(xì)胞，同時(shí)還可以增加H22荷瘤小鼠脾臟中的B細(xì)胞比例，對腫瘤狀態(tài)下的非特異性免疫也起到了活化的作用，從而導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫共同抗肝癌的協(xié)同效應(yīng)，體現(xiàn)參芪五味子顆粒的抗肝癌效應(yīng)主要是通過增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能而實(shí)現(xiàn)，其中以T細(xì)胞的免疫應(yīng)答為主。

參芪五味子顆粒說明書中標(biāo)明成人一天服用量為3～5 g一次，一日3次，即每日最大用量為15 g，根據(jù)生物等效劑量換算成20 g小鼠的每日最大服用量為0.214 g/kg。張文波等給予正常昆明小鼠人用劑量的200倍觀察參芪五味子片的急性毒性作用，發(fā)現(xiàn)小鼠未有中毒反應(yīng)，各臟器正常，提示參芪五味子的安全性較高。故我們選用人用劑量100倍為最高給藥劑量，即21.4 g/kg，荷瘤小鼠灌胃后皮毛色澤與正常無異，亦佐證參芪五味子顆粒安全性較高。

曹永孝等研究發(fā)現(xiàn)參芪五味子膠囊可以增加小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力和分泌抗體能力，朱松明研究發(fā)現(xiàn)參芪五味子片可以改善脾虛模型小鼠免疫功能低下的情況，祝洪艷等研究發(fā)現(xiàn)參芪五味子顆粒協(xié)同戊巴比妥鈉可以對小鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用，但對小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有影響。這些研究提示不同的參芪五味子制劑在不同的病理狀態(tài)下，對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)并不相同。我們的研究發(fā)現(xiàn)，參芪五味子顆粒對肝癌荷瘤狀態(tài)下免疫抑制的小鼠具有以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫與非特性免疫的協(xié)同增強(qiáng)作用，這與臨床上將該藥用于抗腫瘤輔助治療相符合，我們的研究結(jié)果也為參芪五味子作為臨床抗肝癌輔助治療的應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

肝癌腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)是通過多種機(jī)制導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙，包括各種免疫抑制因子的積累、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞募集，使免疫系統(tǒng)對肝癌無法產(chǎn)生有效的反應(yīng)。自然殺傷(NK)細(xì)胞是先天免疫的重要組成部分，NK細(xì)胞在肝臟的免疫功能和對肝癌的免疫防御中起著核心作用。NKT細(xì)胞既具有NK細(xì)胞的功能，又具有T細(xì)胞的特點(diǎn)，通過TNF-α等細(xì)胞因子分泌識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)表明，參芪五味子顆?？纱龠M(jìn)脾臟淋巴NKT細(xì)胞的活化，減少Treg細(xì)胞比例，緩解腫瘤免疫抑制狀態(tài)；提高CD8效應(yīng)T細(xì)胞的比例，通過抑制腫瘤的免疫抑制機(jī)制的同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答。

趙娜等人用HPLC-PDA-ELSD方法對參芪五味子膠囊中的成分含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)10個(gè)有效成分，分別是南五味子以五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素為主；黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黃芪甲苷為主；黨參以黨參炔苷為主；酸棗仁以酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素為主。而譚云龍運(yùn)用UPLC-MS/MS技術(shù)對參芪五味子片的化學(xué)成分進(jìn)行了更精密的分析，確認(rèn)了92個(gè)色譜峰的結(jié)構(gòu)，主要包含木質(zhì)素類、生物堿類、黃酮類與有機(jī)酸類成分。為了探究這些成分在進(jìn)入體后是以什么結(jié)構(gòu)形式存在，譚云龍又對參芪五味子片給予健康大鼠后的含藥血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)四味藥的入血成分略有不同，其中南五味子為五味子酯甲等6種成分，黃芪為芒柄花素、黃芪皂苷I等，黨參為黨參堿等，酸棗仁為麥珠子酸等。但是對于參芪五味子顆粒的成分分析報(bào)道并未發(fā)現(xiàn)，可推測由于各劑型制作工藝接近，所含主要成分應(yīng)相似，亦符合這些成分現(xiàn)代藥理學(xué)研究對于免疫調(diào)節(jié)的結(jié)果，也與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。但是這些成分在肝癌免疫抑制的微環(huán)境中是起到“1+1=2”的作用，還是“1+1>2”的作用有待進(jìn)一步研究。