問婉欣 陳洪巖 韓凌霞

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室 國家禽類實驗動物資源庫，哈爾濱 150069)

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,T.gondii)引起的一種人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布，在哺乳動物、鳥類、貝類、魚類等多種動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，可在有核細(xì)胞內(nèi)寄生，對宿主造成全身性損傷。弓形蟲病感染模型是防治弓形蟲病的重要條件，已報道的弓形蟲病感染模型，包括小鼠[1-13]、大鼠[14-16]、豬[17-19]、山羊[20-21]、雞[22]、貓[23]和犬[24]等。除嚙齒類外，其他感染用動物都不是標(biāo)準(zhǔn)的實驗動物，因此得到的臨床表現(xiàn)和實驗結(jié)果不盡相同，不利于弓形蟲病的進(jìn)一步研究。

犬由于特殊的舔舐行為，容易接觸含有弓形蟲卵囊的土壤，是重要的自然感染宿主，隨著寵物犬的數(shù)量越來越大，建立犬弓形蟲發(fā)病模型對研究和防治犬弓形蟲病的意義愈加明顯[25]。本研究采用經(jīng)過生物學(xué)凈化的實驗用比格犬，在負(fù)壓II級動物生物安全等級實驗室進(jìn)行了弓形蟲感染實驗，以期建立弓形蟲感染犬的發(fā)病模型。

1 材料和方法

1.1 材料

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)RH株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所賈洪林研究員提供，利用Vero E6細(xì)胞系增殖和保存。無特定病原體(specific pathogen-free, SPF)級76日齡雄性比格犬5只，由青島博隆實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)2017-0006。犬弓形蟲特異性血清抗體陰性【利用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供的弓形蟲間接血凝試驗(IHA)試劑進(jìn)行檢測】。感染實驗在青島澳蘭百特生物科技有限公司【SYXK(魯)2017-0013】的動物生物安全等級II級實驗室進(jìn)行。本實驗經(jīng)過該單位的實驗動物使用福利倫理審查，倫理審批號：OLBT20191201，實驗結(jié)束后的動物殘體經(jīng)無害化處理。Premix Ex Taq(Probe qPCR)、pMD18-T(TaKaRa公司)；FastPure GeL Extraction MiniKit(Vazyme公司)；EndoFree Maxi Plasmid Kit、血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒【天根生化科技(北京)有限公司】。

1.2 方法

1.2.1弓形蟲感染犬實驗：將5只76日齡SPF級比格犬分為2組：實驗組3只，編號分別為9190#、9192#、9196#，接種弓形蟲時體質(zhì)量分別為1.5 、1.5和0.95 kg；對照組2只，編號分別為9093#和9098#。在負(fù)壓屏障環(huán)境下分別飼養(yǎng)于兩個房間，采用離地式畜欄飼養(yǎng)，飼料來自青島博隆實驗動物有限公司。實驗組每只腹腔注射1.5×107個弓形蟲速殖子，對照組接種等體積的滅菌PBS。接種后每日8時和14時利用獸用電子測溫計測量直腸溫度各1次，采集咽拭子和肛拭子各1次，用于檢測弓形蟲的B1基因。8 d后結(jié)束實驗，稱量體質(zhì)量，前肢肌肉注射舒泰?50深度麻醉所有犬，經(jīng)瞳孔觀察和肌肉反射檢查，確認(rèn)動物死亡后，剖檢，采集部分肝、脾、肺、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹水、腎和大腦等組織，置于-20 ℃保存，用于提取基因組DNA進(jìn)行弓形蟲核酸定量檢測；另取部分組織立即置于甲醛溶液，用于制備石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。以弓形蟲抗豬高免血清為一抗(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供)，HRP標(biāo)記抗豬IgG為二抗，對感染犬的肝組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.2犬咽拭子和肛拭子中弓形蟲B1基因的PCR檢測：利用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照產(chǎn)品使用說明書，提取實驗犬咽拭子和肛拭子中的基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[26]合成弓形蟲B1基因特異性引物，引物序列為：TPG1∶5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′，TPG2：5′-ACGG ATGCAGTTCCTTTCTG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為580 bp。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10 μL、TPG1 和TPG2 各1 μL(10 μmoL/L)、模板1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)(SmartGelTMImage Analysis System)記錄并保存。

1.2.3犬不同組織中弓形蟲Rep 529 nt定量PCR 檢測：根據(jù)弓形蟲Rep 529 nt 重復(fù)片段建立熒光標(biāo)記實時定量PCR方法[27]。引物Rep529F序列為：5′-GTTGGGAAGCGACGAGAGTC-3′，Rep529R：5′-ATTCTCTCCGCCATCACCAC-3′，探針序列為 5′-FAMAGAAGATGTTTCCGGCTTGGCTGCTTTAMRA-3′。先擴(kuò)增Rep529 nt，構(gòu)建重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系為：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL、Rep529F和Rep529R各2.5 μL(10 μmoL/L) 、模板5 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸5 min。常規(guī)方法克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)吉林省庫美生物技術(shù)有限公司測序鑒定。將質(zhì)粒利用紫外分光光度計測定濃度，連續(xù)10倍稀釋，每個稀釋度3次重復(fù)，繪制熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量PCR反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 10 μL、Rep529F 和Rep529R各0.4 μL(10 μmoL/L) 、探針 0.8 μL、模板 2 μL、去離子水 6.4 μL。定量PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用QuantStudio 5熒光定量PCR儀對結(jié)果進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，提取犬不同組織中的基因組DNA，測定濃度和純度后，檢測弓形蟲Rep529 nt重復(fù)片段的拷貝數(shù)。每個被檢樣品設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 犬感染弓形蟲后的臨床癥狀

攻毒犬和對照犬的食欲和精神狀態(tài)均無明顯異常。實驗犬感染弓形蟲后第3天，犬9192#和9196#的眼角出現(xiàn)少量分泌物；4 dpi至6 dpi時，9190#的鼻鏡表觀發(fā)干；隨著病程延長，逐漸出現(xiàn)腹瀉，6 dpi時全部為稀便。攻毒犬8 d的平均體溫、最低溫度和最高溫度均高于對照犬，在4 dpi或5 dpi達(dá)到39.0 ℃，攻毒時體溫(0 dpi)及攻毒后的體溫變化見圖1。

圖1 犬接種弓形蟲后的體溫變化Fig.1 Body temperature curves ofT. gondii-infected dogs

2.2 拭子中弓形蟲B1基因的PCR檢測

對咽拭子和肛拭子中的弓形蟲核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，攻毒犬在1 dpi即能從犬9192#的肛拭子中擴(kuò)增出陽性條帶，接著從咽拭子和肛拭子中擴(kuò)增條帶，最后的陽性檢出樣品是6 dpi犬9192#的肛拭子。所有的樣品中肛拭子的陽性率高于咽拭子，3 dpi時陽性樣品的數(shù)量最多，對照犬PCR結(jié)果陰性，見表1。

表1 感染犬的口腔拭子和肛拭子中弓形蟲核酸的PCR檢測結(jié)果Table 1 PCR results in the oral and anal samples of T.Gondii-infected dogs

2.3 大體病變及病理組織學(xué)檢測結(jié)果

接種8 d后，感染犬體溫正常，無明顯臨床癥狀，結(jié)束實驗。剖檢發(fā)現(xiàn)，3只攻毒犬均產(chǎn)生不同程度的腹水，清亮無異味或呈棕色(圖2A)。組織學(xué)檢測結(jié)果表明，感染犬的肝(圖2B)細(xì)胞大量變性壞死，伴有局灶性炎性細(xì)胞浸潤；腎小管(圖2C)上皮細(xì)胞部分變性，少量壞死；扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)均出現(xiàn)巨噬細(xì)胞輕度增生，脾出現(xiàn)局灶性含鐵血紅素沉積，胰腺有少量腺泡細(xì)胞變性，嗜堿性增強(qiáng)。卵巢、盲腸、十二指腸、回腸和直腸無明顯異常。對照犬未見異常。以弓形蟲抗豬高免血清為一抗，對9196#犬的肝臟進(jìn)行免疫組化檢測，未見明顯特異性顯色(圖2D)。

注：A：感染犬腹腔腹水；B：感染犬肝；C：感染犬腎； D：感染犬肝的弓形蟲特異性免疫組化Note：A: ascite in infected caine; B: infected liver; C: infected kidney; D:IHC result of infected liver圖2 犬感染弓形蟲后的大體病變和病理組織學(xué)變化Fig.2 Gross changes and histopathological observations of T.Gondii-infected dogs

2.4 不同組織中弓形蟲核酸拷貝數(shù)的定量檢測

構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pMD-Rep529。以質(zhì)粒的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-4.642x+54.498，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995。感染8 d后對犬安樂死，對犬的主要組織臟器中含有的弓形蟲核酸拷貝數(shù)進(jìn)行定量比較，結(jié)果表明弓形蟲主要存在于腸系膜淋巴結(jié)、肝和盲腸，見圖3。

圖3 感染犬不同組織中弓形蟲核酸拷貝數(shù)Fig.3 Nucleotide copies of T. gondii in various tissues of the infected dogs

3 討論

弓形蟲為胞內(nèi)寄生蟲，對寄生的細(xì)胞類型沒有選擇性，臨床癥狀因受感染的細(xì)胞不同而出現(xiàn)不同的反應(yīng)。健康成年動物表現(xiàn)為亞臨床，幼年動物因多種組織器官的炎性反應(yīng)表現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、黃疸、癲癇甚至死亡。自然感染途徑為消化道感染成熟卵囊致病，但只有在貓體內(nèi)才能形成裂殖體、配資體和卵囊的形態(tài)，因此弓形蟲感染模型較難完全復(fù)制出自然感染癥狀。

實驗用比格犬來自人工哺乳、隔離器內(nèi)喂養(yǎng)生長，生物進(jìn)化的比格犬，其親代在人流、物流和氣流環(huán)境受到嚴(yán)格控制，按照GB 14922.2—2011《實驗動物微生物等級及監(jiān)測》的規(guī)定免疫了狂犬病、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒和犬傳染性肝炎疫苗，在遺傳背景、攜帶病原體、飼料營養(yǎng)等方面的個體差異較小。感染實驗設(shè)施為屏障環(huán)境。采用腹腔接種體外培養(yǎng)的速殖子的方式，以盡量準(zhǔn)確計數(shù)速殖子數(shù)量，但因此有可能降低了對犬的致病性。

感染犬出現(xiàn)一過性發(fā)熱，在4 d左右體溫升高至39 ℃，持續(xù)1～2 d恢復(fù)至正常。有報道[24]4只腹腔接種104個RH株速殖子犬的體溫在7至14 d后略有升高，只有1只犬出現(xiàn)食欲減退、腹瀉和呼吸急促，55 d后死亡，另3只犬直到62 d僅出現(xiàn)中度癥狀。與本實驗結(jié)果相似。利用肉雞人工腹腔接種1×108、1×107或1×106個JS株速殖子后2 d，直腸溫度也短時升高[22]。嚙齒類動物感染模型的報道未提供體溫數(shù)據(jù)，或許與發(fā)熱時間短不易觀察有關(guān)。結(jié)果表明單因子弓形蟲感染，會短時溫和升高動物體溫。

輕度短時腹瀉是弓形蟲感染的另一個癥狀。本實驗中比格犬在接種后先后出現(xiàn)腹瀉，6 d時觀察到的糞便全部為稀便(每日兩次清除糞便)，之后稀便的比例逐漸減少，至8 d時恢復(fù)正常。與組織病理學(xué)檢測結(jié)果犬的十二指腸、回腸、盲腸和直腸未見明顯異常相符合。但大鼠口服5 000個ME-49株卵囊后觀察到腸黏膜下層和肌層萎縮，腸細(xì)胞高度降低，杯狀細(xì)胞增多，十二指腸的變化與感染時間成正比[15]。

本研究中3只感染犬均出現(xiàn)少量腹水，呈暗紅色或透明無色，清亮不渾濁。組織學(xué)檢測結(jié)果，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量變性壞死，伴局灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤，與已報道的弓形蟲感染結(jié)果一致，例如門靜脈和中央靜脈周圍淋巴細(xì)胞浸潤[16]，局灶性充血、變性和壞死[28]，肝竇增大[22]，在個別細(xì)胞中抗原呈陽性[28]。但沒有觀察到明確的由宿主細(xì)胞膜包繞而成的假包囊，也未見明顯的蟲體自身分泌物形成的包囊，可能與感染后時間較短(8 d)，或者宿主(SPF級幼犬)相對于體外滋養(yǎng)體的抵抗能力較強(qiáng)有關(guān)。肺臟也易引起病變[16,22,28]，本研究中感染犬的扁桃體僅出現(xiàn)輕微增生。定量PCR檢測結(jié)果標(biāo)明，弓形蟲在宿主體內(nèi)的分布沒有明顯的組織特異性。

制備疫病感染模型標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化病原體和宿主。中等毒力弓形蟲毒株常造成隱性感染，RH株是代表性強(qiáng)毒株。利用SPF級比格犬腹腔接種弓形蟲RH株，主要引起一過性體溫升高和明顯的短時腹瀉，導(dǎo)致肝組織變性和壞死，對腸道無明顯損傷，糞便相比于口腔是更重要的排蟲方式。

弓形蟲基因型眾多，人犬共感染情況不容忽視，建立弓形蟲感染犬發(fā)病模型對防治犬弓形蟲病具有一定的提示作用。