馬立艷 孫 偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050)

腸道微生物群對于維持其內(nèi)環(huán)境的平衡和免疫起著重要作用。其免疫功能的失衡常由腸道內(nèi)正常微生物群遭到破壞而引發(fā)[1-3]。益生菌可優(yōu)化腸道菌群構(gòu)成、產(chǎn)生抗炎因子、抑制有害菌群生長、增強(qiáng)腸道黏膜免疫，從而預(yù)防和治療一些消化道疾病[4-5]。

腸道正常菌群中的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)細(xì)菌是益生菌的重要成員，對維持腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)腸道的免疫功能尤為重要[6]。研究表明，乳酸菌對免疫功能的調(diào)控是多方面的，如通過增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞活性可以增強(qiáng)非特異性免疫應(yīng)答，通過刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖、加強(qiáng)體液免疫功能等增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，還可以提高機(jī)體自然殺傷細(xì)胞的活性等。由于不同乳酸菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，其進(jìn)入機(jī)體后，對腸道免疫細(xì)胞產(chǎn)生的作用不同[7-9]，故其對機(jī)體產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)作用也不同。研究表明，乳雙歧桿菌BL-99增強(qiáng)機(jī)體免疫的機(jī)制與促進(jìn)免疫球蛋白A的分泌，刺激腸黏膜淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞功能有關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌M8增強(qiáng)大鼠免疫功能的機(jī)制與刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、提高淋巴細(xì)胞比例和誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌有關(guān)[11]。

乳雙歧桿菌V9(BifidobacteriumlactisV9)是分離自內(nèi)蒙古草原上健康兒童腸道中的雙歧桿菌乳亞種，對人工胃液、腸液以及膽鹽有良好的耐受性[12]。本研究旨在通過檢測和評估乳雙歧桿菌V9對小鼠免疫器官指數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞免疫、體液免疫功能，以及對NK細(xì)胞活力等的影響，進(jìn)一步明確乳雙歧桿菌V9的體內(nèi)作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

刀豆蛋白A(ConA)、Hank′s溶液、0.4%錐蟲蘭溶液(北京索萊寶科技有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；MTT試劑、LDH檢測試劑盒(Abcam公司)；印度墨汁、YAC-1細(xì)胞、20%雞紅細(xì)胞(上海源葉生物科技有限公司)；1% NP40、0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH = 8.2)(碧云天生物科技有限公司)；乳雙歧桿菌V9菌粉(2×1011/g)(金華銀河生物科技有限公司)。稱取冷凍干燥保存的乳雙歧桿菌V9菌粉，用雙蒸水溶解后備用[13-15]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及給藥

SPF級C57BL/6J雄性小鼠320只，體質(zhì)量18～22 g，來源于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】。動物飼養(yǎng)于北京康華投資有限公司嚙齒類動物SPF級屏障環(huán)境【SYXK(京)2020-0001】，室溫(23±2)℃，相對濕度：40%～70%，12 h/12 h明暗交替，自主飲食和飲水。本研究所有動物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動物倫理和動物福利的要求，按照美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南》和北京市實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)由北京神瑞生物技術(shù)有限公司倫理委員會審查，倫理審批號：SRSWLL-2021091802。

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)中免疫力評價(jià)方面的規(guī)定，對乳雙歧桿菌V9進(jìn)行評價(jià)[16]。將小鼠隨機(jī)分為8個(gè)免疫組，分別進(jìn)行動物臟器指數(shù)測定、小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)檢測、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測定、抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活力檢測。每個(gè)免疫組設(shè)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組10只。陰性對照組灌胃給予雙蒸水，其他3組分別灌胃給予低、中、高劑量的乳雙歧桿菌V9菌粉(0.5、1.0、3.0 mg/kg)，每日1次，持續(xù)30 d。每日觀察記錄小鼠狀態(tài)，每周稱重。

1.3 小鼠臟器指數(shù)(organ index，OI)的計(jì)算

分別灌胃給予不同劑量的乳雙歧桿菌V9 30 d后，將小鼠脫臼處死，無菌操作臺上取出脾臟、胸腺，分別進(jìn)行稱重，并計(jì)算各鼠的臟器指數(shù)：OI=胸腺或脾重量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

無菌取脾，磨碎后過濾，將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×106個(gè)/mL。將細(xì)胞加至24孔板中，1.0 mL/孔，實(shí)驗(yàn)組加75 μL ConA/孔(終濃度為7.5 μg/mL)，對照組加75 μL無菌水/孔，設(shè)3～5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h棄上清，每孔吸去上清0.7 mL，同時(shí)加入等體積RPMI1640培養(yǎng)基(不含血清)，加入MTT至終濃度為0.5 mg/mL。4 h后，棄上清，加酸性異丙醇1.0 mL/孔，混均置室溫20 min。分別吸取200 μL各孔樣品至新的96孔板中，570 nm處測定各孔的A值[17]。

1.5 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實(shí)驗(yàn)(耳腫脹法)

小鼠腹部脫毛后，取50 μL 1%二硝基氟苯(DNFB)溶液，均勻涂抹在小鼠脫毛后的腹部皮膚。5 d后，取20 μL 1% DNFB溶液涂抹于各組小鼠的右耳上。24 h后，采用打孔器取相同大小的左右耳片進(jìn)行稱重。以左耳為對照，用兩耳片的重量之差表示DTH的程度[18]。

1.6 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

將稀釋后印度墨汁尾靜脈注入小鼠，0.1 mL/10 g。于注入墨汁第2、10 min經(jīng)內(nèi)眥靜脈叢各取血20 μL，分別加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液為空白對照，721分光光度計(jì)在600 nm處測定各孔的A值。按文獻(xiàn)方法計(jì)算各組小鼠的吞噬指數(shù)α來衡量其碳廓清能力[18]。

1.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)

用1 mL的20%雞紅細(xì)胞懸液免疫小鼠。30 min后處死小鼠，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，2 mL/只，吸取腹腔液，滴于載玻片，按照文獻(xiàn)方法分別計(jì)算吞噬指數(shù)和吞噬百分率[13]。

1.8 血清溶血素測定

收集綿羊紅細(xì)胞，用0.9%氯化鈉溶液配成體積比為2%的細(xì)胞混懸液，腹腔注射至小鼠體內(nèi)。4 d后，摘除眼球采血，收集血清。取300倍稀釋后的血清1.0 mL，依次加入10%SRBC 0.5 mL、補(bǔ)體1.0 mL，反應(yīng)20 min后，離心取上清1.0 mL，加都氏試劑3.0 mL。以10%SRBC 0.25 mL加都氏試劑4.0 mL混勻后作空白對照。540 nm處測定各管A值。

1.9 抗體生成細(xì)胞檢測

同1.6方法免疫小鼠，4 d后處死小鼠，無菌操作臺上取出脾臟，研磨后過濾，制成5 ×106個(gè)/mL的脾細(xì)胞懸液。溶血空斑實(shí)驗(yàn)檢測抗體生成細(xì)胞數(shù)(空斑數(shù)/106脾細(xì)胞數(shù))。

1.10 NK細(xì)胞活力測定

收集YAC-1細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至4×105個(gè)/mL。無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。以效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞=50∶1的比例將這兩種細(xì)胞加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，以加靶細(xì)胞+培養(yǎng)液各100 μL的孔作為靶細(xì)胞自然釋放孔，以加靶細(xì)胞+1%NP40各100 μL的孔作為靶細(xì)胞最大釋放孔，按照文獻(xiàn)方法測定各孔A值[8]，并計(jì)算NK細(xì)胞活性(%)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對小鼠臟器指數(shù)的影響

給藥期間，各給藥組和對照組小鼠的生活狀態(tài)良好，未觀察到腹瀉等現(xiàn)象。各組小鼠均未出現(xiàn)中毒或死亡現(xiàn)象。各組小鼠的初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。各組小鼠的免疫臟器指數(shù)檢測結(jié)果由表1可知，連續(xù)灌胃給予0.5、1.0、3.0 mg/kg 3個(gè)劑量的乳雙歧桿菌V9 30 d后，各組小鼠的脾指數(shù)(脾/體質(zhì)量比值)、胸腺指數(shù)(胸腺/體質(zhì)量比值)與空白對照組相比均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P> 0.05)。

表1 不同劑量乳雙歧桿菌V9給藥組及對照組小鼠的臟器指數(shù)Table 1 Bifidobacterium lactis V9 on mice organs ratios to body

2.2 對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.2.1對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：不同劑量乳雙歧桿菌V9對ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖作用結(jié)果見表2。由表2可知，與對照組相比，3個(gè)劑量組的A差值均有所增高，表明脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

2.2.2小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)：由表2可知，與空白對照組相比，3個(gè)劑量組的乳雙歧桿菌V9給藥組小鼠的耳廓腫脹度差異均不顯著(P>0.05)。

表2 不同劑量乳雙歧桿菌V9給藥組、對照組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化及耳廓腫脹度的影響Table 2 Effects of Bifidobacterium lactis V9 on ConA-induced mouse splenic lymphocyte transformation ability and delayed hypersensitivity induced by

2.3 對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

2.3.1小鼠碳廓清功能：不同劑量乳雙歧桿菌V9對小鼠碳廓清能力的影響結(jié)果見表3。由表3可知，與空白對照組相比，中、高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)α與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3.2巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬能力的影響：由表3可知，給予小鼠0.5、1.0、3.0 mg/kg乳雙歧桿菌V9 30 d后，中、高乳雙歧桿菌V9組的吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 不同劑量乳雙歧桿菌V9給藥組及對照組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能Table 3 Bifidobacterium lactis V9 on the function of monocyte macrophage of the

2.4 對小鼠體液免疫功能的影響

2.4.1小鼠半數(shù)溶血值(HC50)：表4為不同劑量乳雙歧桿菌V9對小鼠半數(shù)溶血值的影響。由表4可知，中、高劑量的乳雙歧桿菌V9組的HC50值與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.4.2對溶血空斑數(shù)的影響：由表4可知，3個(gè)不同劑量的乳雙歧桿菌V9組的空斑數(shù)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同劑量乳雙歧桿菌V9給藥組及對照組小鼠HC50與空斑數(shù)Table 4 Bifidobacterium lactis V9 on HC50 and number

2.5 對小鼠NK細(xì)胞活力的影響

表5為不同劑量乳雙歧桿菌V9對小鼠NK細(xì)胞活性的影響結(jié)果。由表5可知，高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 不同劑量乳雙歧桿菌V9給藥組及對照組NK細(xì)胞活性Table 5 Bifidobacterium lactis V9 on NK

3 討論

乳酸菌作為體內(nèi)的正常菌群，具有調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成、增強(qiáng)腸道黏膜免疫、抗氧化、抗癌等功效，越來越引起醫(yī)藥學(xué)、保健品、微生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域的關(guān)注[19]。乳酸菌是目前研究最多且應(yīng)用最為廣泛的益生菌之一。不同乳酸菌株的免疫調(diào)節(jié)功能常因菌株類型而異。健康兒童腸道中分離出來的乳雙歧桿菌V9，是益生菌的一種，為動物雙歧桿菌乳亞種，除了具備良好的耐酸性，還能耐受人工胃液、腸液以及膽鹽[20]。本研究通過測定小鼠臟器/體質(zhì)量比、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力、DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH強(qiáng)弱、溶血空斑數(shù)目、HC50值、NK細(xì)胞活性等各指標(biāo)以綜合評估乳雙歧桿菌V9對小鼠免疫功能的影響。

免疫系統(tǒng)功能的強(qiáng)弱通常用免疫系統(tǒng)的臟器系數(shù)來判定，其中胸腺指數(shù)和脾指數(shù)作為間接反映機(jī)體的免疫水平的指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示，乳雙歧桿菌V9低、中、高劑量組的小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)與對照組結(jié)果相近，明確了乳雙歧桿菌V9的安全可行。ConA可選擇性刺激T細(xì)胞的增殖，細(xì)胞免疫功能可用其轉(zhuǎn)化率來體現(xiàn)。而本研究結(jié)果表明，隨著乳雙歧桿菌V9劑量的增高增殖轉(zhuǎn)移能力逐漸上升，提示轉(zhuǎn)化率明顯增高。此外還證實(shí)了高劑量組的乳雙歧桿菌V9均可顯著提高小鼠碳廓清能力及巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬能力，表示給予一定高劑量的乳雙歧桿菌V9可通過提高吞噬功能以提高免疫廓清能力，從而增加機(jī)體非特異性免疫力。SRBC細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)產(chǎn)生溶血素的能力常通過測定HC50值來評價(jià)。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量乳雙歧桿菌V9均能顯著提高小鼠HC50值。不同于T細(xì)胞和B細(xì)胞，NK細(xì)胞可非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞及感染病毒的細(xì)胞，而主要機(jī)制與抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)關(guān)系密切[22]。而在本研究結(jié)果中，乳雙歧桿菌V9高劑量下，通過增強(qiáng)NK細(xì)胞活性提高NK細(xì)胞殺傷力，以增強(qiáng)機(jī)體抵御外邪的能力。

本研究證實(shí)了乳雙歧桿菌V9的安全可靠性，并通過調(diào)節(jié)小鼠免疫系統(tǒng)能提高其免疫力。尚需通過擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量來進(jìn)一步研究免疫機(jī)制，從而深入探究乳雙歧桿菌V9對免疫系統(tǒng)的作用方式。

綜上所述，乳雙歧桿菌V9達(dá)到一定劑量時(shí)主要通過提高細(xì)胞自身免疫力、增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞功能、體液免疫功能，以及加強(qiáng)NK細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)小鼠的免疫系統(tǒng)防御能力。本研究結(jié)果為益生菌乳雙歧桿菌V9增強(qiáng)免疫力的功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為其進(jìn)一步的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。