房 曉 段榮帥 張曉元 張艷艷 孫曉康 陳 磊

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術學院,濟南 250103)(2.山東省藥學科學院，濟南 250101)

益生菌具有維持腸道菌群平衡、改善便秘、緩解腹瀉、降膽固醇、增強免疫力等功效[1]。在全面大健康的時代背景之下，人們生活水平和健康意識日益增強，益生菌的保健作用越來越受到人們的重視。益生菌在功能性食品、保健食品、藥品等領域都有廣泛的應用前景。有些腸內益生菌可有效將體內碳水化合物發(fā)酵成為乳酸，研究者將這類細菌的總稱命名為乳酸菌，其效用在市面上和研究中都被廣泛認可。乳酸菌種屬很多，如乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)，是現(xiàn)在市面上應用最廣泛的菌種?？股啬退幖绑w內微環(huán)境失衡仍是目前棘手問題，乳桿菌和雙歧桿菌的益生劑也進入了專家和學者們的視線[2-3]，相關研究也正在開展。

我國內蒙古地區(qū)盛產(chǎn)奶制品，營養(yǎng)價值極高，為進一步提高奶制品食品安全和效用。自2001年以來，專家們開始將研究重點轉移至奶制品成分分析中，以期得到優(yōu)質益生菌株，加強和改善奶制品質量。目前已經(jīng)分離出的優(yōu)質菌株包括干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang，L.casei Zhang)[4]、植物乳桿菌P-8(LactobacillusplantarumP-8, P-8)[5]、植物乳桿菌P9(LactobacillusplantarumP9, P9)[6]、鼠李糖乳桿菌R9639(Lactobacillusrhamnosus,R9639)[7]、乳雙歧桿菌V9(BifidobacteriumlactisV9，B.lactis V9)及乳雙歧桿菌XLTG11(Bifidobacteriumlactis，XLTG11)[8]等。上述菌株主要來源于傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶、自然發(fā)酵的酸牛奶、自然發(fā)酵的酸馬奶、健康兒童腸道等。這些菌株對人工胃液、腸液及膽鹽等均有良好耐酸性，是國內外目前用于開發(fā)的最重要的益生菌[4,9]。

近年來大量的研究表明，與單一的乳酸菌制劑相比，混合菌制劑表現(xiàn)出更好的免疫調節(jié)、抗感染等生物學功能[10-12]。但混合菌制劑的安全性有待于進一步考察。為了保證應用安全，本文對R9639+ L.casei Zhang +P-8+P9+ B.lactis V9+XLTG11組成的混合菌粉進行了28 d經(jīng)口毒性研究，為其進一步的應用開發(fā)提供安全實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

受試物L.casei Zhang+R9639+P9+V9+P-8+XLTG11的活菌數(shù)均為2×1011個/g(金華銀河生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司)；血液分析儀試劑(Sysmex公司)；血凝儀專用試劑(美創(chuàng)公司)；尿液分析專用試劑(優(yōu)利特公司)。

去離子水發(fā)生器(Millipore公司)；OLYMPUS光學顯微鏡BX50(奧林巴斯公司)；HITACHI U-2000型分光光度計(日立公司)；冷凍離心機Sigma4-16K(Sigma公司)；Cubis? II分析天平(賽多利斯公司)；ndiko自動生化分析儀(Thermo Scientific公司)；血細胞分析儀 XT-4000i (Sysmex公司)；全自動血凝儀Coatron 3000(美創(chuàng)公司)；尿液分析儀URIT-330(優(yōu)利特公司)；ASP200S全封閉式組織脫水機和手動石蠟切片(Leica公司)。

1.2 實驗動物及給藥

SPF級SD大鼠80只，雌、雄各半，體質量68.4～80.1 g購自斯貝福(北京)生物技術有限公司【SCXK(京)2019-0010】。無菌手術于北京神瑞生物技術有限公司屏障環(huán)境動物設施【SYXK(京)2020-0001】進行，每籠4～5只，常規(guī)飼養(yǎng)。本實驗由北京神瑞生物技術有限公司倫理委員會批準，動物倫理審批號：SRSWLL-2021091802動物房。

稱取冷凍干燥保存的L.casei Zhang、R9639、P9、V9、P-8、XLTG11按照質量比2∶2∶1∶1∶1∶1的比例，用雙蒸水溶解后備用。該配比是參考實驗室前期各菌種在腸道的存活率和耐受性等確定的。SD大鼠隨機分為4組，參考前期急性毒性實驗劑量和人體實際攝入量[4,6,13]，分別灌胃給予雙蒸水、含1.0、2.05、4.15 g/kg劑量的混合菌粉水溶液，每次灌胃容量為0.1 mL/20 g，每日1次，連續(xù)28 d。

1.3 檢測指標

一般狀態(tài)：實驗期間每日觀察大鼠活動、生長、呼吸、排便、死亡等狀況；每周稱量體質量和飼料。計算進食量及食物利用率，食物利用率=實驗期間動物體質量增加(g)/實驗期間動物總進食量(g)×100%。

眼部檢查：實驗前和實驗結束時，對高劑量組和對照組實驗動物進行眼部(角膜、球結膜、虹膜)檢查。

臟器指數(shù)測定：28 d灌胃結束后禁食16 h，處死大鼠，肉眼檢查大鼠體表、體腔及臟器，并分別取出心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸，稱重，計算各組大鼠的臟器指數(shù)。

血液學及血液生化指標：28 d灌胃結束、處死前取血，檢測紅細胞數(shù)(RBC)、白細胞數(shù)(WBC)及淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(NEUT)及其他鏡檢分類、血小板計數(shù)(PLT)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)；檢測血中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、堿性磷酸酶(AKP)、尿素(Urea)、肌酐(Cre)、血糖(Glu)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、氯、鉀、鈉[14]。

尿液檢查：處死大鼠前，用代謝籠收集大鼠尿液，檢測尿中尿蛋白、尿比重、pH、Glu和潛血。

組織病理學檢查：首先對解剖后大鼠的各個臟器進行大體檢查，如未見異常，對高劑量組與對照組大鼠的腦、甲狀腺、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、結腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、睪丸、膀胱等臟器做病理組織學檢查。取各組織0.9%氯化鈉溶液沖洗，按1∶20(W/V)固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，顯微鏡下觀察各組織有無病理學改變，并記錄[15]。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 10.0軟件分析，采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗，成對組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般體征觀察

對照組及灌胃給予不同劑量混合菌粉的各組雌雄大鼠毛色、黏膜、分泌物、活動、生長發(fā)育等狀況均良好，飲食、糞便及精神狀態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)死亡、腹瀉等異常現(xiàn)象。

2.2 眼部檢查結果

試驗開始后，分別于試驗早期、中期、末期3個不同階段，分別對實驗大鼠進行眼部檢查。與對照組一樣，高劑量組大鼠的眼角膜、球結膜及虹膜檢查等一般情況良好，均無異常癥狀。

2.3 體質量、進食量、食物利用率情況

給予不同劑量的混合菌粉期間，各組大鼠體質量均逐漸緩慢上升，各組間略有波動，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比，不同劑量組進食量比較均無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組大鼠總增重、總進食、總食物利用率情況見表1。雌、雄大鼠對照組及各劑量組總增重、總進食、總食物利用率未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠灌胃給予不同劑量的混合菌粉28 d的體質量增長量、總攝食量、總食物利用率Table 1 Total weight changes, food intake, food utilization rates of rats in different groups treated with mixed lactobacter powder in 28 days

2.4 臟器指數(shù)測定結果

不同劑量混合菌粉對雌雄大鼠重要臟器臟體比的影響詳見表2?？梢钥闯?，連續(xù)灌胃28 d后，低、中、高3個劑量組大鼠的心臟體比與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝和腎是機體的主要代謝和排泄器官，肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)的變化可以反應菌粉對機體的代謝和排泄器官的影響。從表2可以看出，與對照組相比，各組大鼠的肝體比和腎體比均未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。脾臟和胸腺指數(shù)可初步反應機體的免疫功能強弱，從表2可以看出，各組大鼠的脾體比和胸腺體比與對照組相比均無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。此外，各組大鼠的腎上腺體比與對照組相比無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)，各組雄性大鼠的睪體比與對照組相比均無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)，進一步證明了該混合菌粉的安全性。

表2 各組大鼠在灌胃給予不同劑量的混合菌粉28 d后臟體比Table 2 Organs to body weight ratios of rats in different groups treated with mixed lactobacter powder

2.5 血液學檢查結果

2.5.1對大鼠血常規(guī)的影響：雌、雄大鼠血常規(guī)檢測結果見表3?？梢园l(fā)現(xiàn)，各組血常規(guī)檢測值均在正常參考值范圍內。組內部分血常規(guī)檢測值之間雖存在一定的差異，但與對照組相比，各給藥組未出現(xiàn)顯著性改變，且指標結果均在本實驗室歷史對照范圍內，因此不認為有生物學意義。與對照組相比，各劑量組大鼠PT和APTT指標未出現(xiàn)顯著性改變(P>0.05)，提示該混合菌粉對凝血無顯著影響?？梢?，該混合菌粉對大鼠血常規(guī)主要指標無顯著影響。

表3 不同劑量的混合菌粉對大鼠血常規(guī)指標的影響Table 3 Effects of mixed lactobacter powder on the hematology values of rats

2.5.2血生化檢查結果：各劑量組雌、雄大鼠的血清生化指標均在正常范圍(表4)。大鼠部分指標如TP、ALT、AST、ALP、TG與對照組相比存在一定差異(P<0.05)，指標結果均在本實驗室歷史對照范圍內，因此不認為有生物學意義。其他各指標與對照組相比差異不顯著。各劑量組之間的各指標值未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，且沒有劑量依賴性關系。這表明，該混合菌粉對大鼠血生化各指標無顯著影響。

表4 不同劑量的混合菌粉對大鼠血生化指標的影響Table 4 Effects of mixed lactobacter powder on the biochemical indicators of rats n=10)

2.6 尿液檢查結果

各劑量組大鼠的尿常規(guī)分析結果表明，與對照組比，各劑量組大鼠尿比重、pH值未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。且各組大鼠尿液中均未發(fā)現(xiàn)尿蛋白、尿潛血現(xiàn)象。

2.7 病理學觀察

28 d灌胃結束后，觀察受試動物體表外觀變化和體腔內臟器病理檢查，未見發(fā)現(xiàn)顯著改變。取對照組和高劑量組所有大鼠腦、胸腺、甲狀腺、心臟、腎上腺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、結腸、胰腺、腸系膜淋巴結、卵巢、睪丸、膀胱等進行組織病理學檢查，主要臟器的HE染色結果見圖1。檢查發(fā)現(xiàn)，在對照組和高劑量組中，各有1只大鼠出現(xiàn)了支氣管壁炎性細胞浸潤、充血現(xiàn)象；另外，各有1只大鼠出現(xiàn)了黏膜淋巴細胞增生。但這些病理改變無特異性，無劑量依賴性，考慮為自發(fā)性病變。

圖1 對照組和高劑量組大鼠主要臟器的HE染色結果Fig.1 Histological analysis of main organs excised from rats in the control and high dose groups (scale bar, 2 000 μm)

3 討論

在益生菌的研究開發(fā)和市場應用中，屬雙歧桿菌、乳桿菌最為重要和廣泛，主要由于這兩種菌株有顯著控制腸道感染、均衡菌群、增強腸道免疫力及抗腫瘤等多種功效。近年來大量的研究表明，與單一的乳酸菌制劑相比，混合菌制劑表現(xiàn)出更好的免疫調節(jié)、抗感染等生物學功能[11-12]。乳酸菌R9639、L.casei Zhang、B.lactis V9、乳桿菌P-8、P9、 XLTG11等均具有優(yōu)良的益生性能，逐漸成為業(yè)界的研究熱點[5-7]。研究證實，生菌在不同的生存環(huán)境下，其代謝過程及代謝產(chǎn)物可能完全不同[16]。因此，即便是公認的安全性良好的益生菌，安全性評價仍是其被制備為混合菌制劑后必不可少的環(huán)節(jié)[17]。

食用益生菌的安全性在世界范圍內已經(jīng)得到廣泛重視[18-19]。如何評價益生菌的安全性要視試驗的效果和菌株而異[20-21]。如采用溶血試驗、抗菌藥物敏感試驗、斑點叉尾鮰急性毒性試驗、凡納濱對蝦急性毒性試驗、破損皮膚刺激性試驗、急性眼刺激試驗和急性腹腔注射試驗等指標進行了蝦源蠟樣芽胞桿菌D7的毒理學評價[19]。采用雌雄小鼠急性毒性試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗等對Mix-G200益生菌粉進行安全性試驗[20]。KABEIR等[21]采用灌胃法給與小鼠不同劑量的假鏈狀雙歧桿菌菌粉進行血清酶試驗、肝臟指數(shù)測定及腸道組織學染色等來評價其安全性。也有研究者通過急性毒性試驗、小鼠組織學形態(tài)觀察和肝臟功能定等研究益生菌的安全性[10]。

目前我國對無傳統(tǒng)食用習慣的益生菌制劑的毒理學評價要求包括急性經(jīng)口毒性試驗、致病性試驗、三項遺傳毒性試驗、28 d經(jīng)口毒性試驗、致畸試驗和生殖毒性試驗(依國內外食用情況確定)[18]。本研究混合菌粉中的R9639、L.casei Zhang、P-8+P9+ B.lactis V9、XLTG11菌株主要來源于傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶、自然發(fā)酵的酸牛奶、自然發(fā)酵的酸馬奶、健康兒童腸道等。前期的急性毒性試驗及相關指標檢測結果均顯示L.casei Zhang及B.lactis V9凍干粉無毒副作用作用[10,22]。本文在前期急性毒性研究的基礎上進行了R9639、L.casei Zhang、P-8+P9+ B.lactis V9、XLTG11混合菌粉的28天經(jīng)口毒性試驗，并參考實驗室前期各菌種在腸道的存活率和耐受性等確定了其配比。

本文重點從給予不同劑量的菌粉后大鼠的一般狀態(tài)、攝食量、食物利用率、總增重、眼部檢查、臟器指數(shù)、血液學檢查、尿常規(guī)及組織病理學狀態(tài)等方面研究了該混合菌粉對大鼠的毒性作用。給藥28 d期間，各組大鼠生長情況良好，體質量逐漸增長，但各組間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。且給藥期間，各給藥組大鼠的行為、糞便、攝食量、總增重、總進食、總體食物利用率等均未發(fā)現(xiàn)顯著異常(表1，P>0.05)。高劑量組和對照組大鼠試驗前后眼部檢查結果均無異常。各劑量組大鼠血液學指標均在正常值范圍內，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

臟器指數(shù)測定及HE病理學染色也是評價藥物對機體重要臟器影響的常用手段。臟器指數(shù)測定結果表明，與對照組相比，各給藥組大鼠臟體比均未發(fā)現(xiàn)顯著改變。HE病理學染色結果表明，高劑量組組織病理學檢查結果基本在正常形態(tài)學范圍內，與對照組比較，無顯著性差異，這進一步證明了其安全性。

益生菌安全性評價的內容除了急性經(jīng)口毒性試驗、28 d經(jīng)口毒性試驗外，還包括致病性試驗、3項遺傳毒性試驗、致畸試驗和生殖毒性試驗等。本文所進行的28 d經(jīng)口毒性試驗初步證明了其安全性。其全面的安全性評價尚需進一步的試驗來證明。