魏 杰 王 洪 光姣娜 周佳琪 付 瑞 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

蘋果酸脫氫酶(malic enzyme，ME)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydorgenase，IDH)是三羧酸循環(huán)及其補(bǔ)充反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，在生物體能量代謝、合成及抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]。同工酶家族中ME-1和IDH-1的研究，不僅在生物發(fā)酵、種質(zhì)選育以及腫瘤診療中發(fā)揮著重要作用，也是實驗動物遺傳質(zhì)量控制國家標(biāo)準(zhǔn)中近交系小鼠的重要評價項目[3-6]。

我國檢測機(jī)構(gòu)眾多，一方面有助于加強(qiáng)對產(chǎn)品的質(zhì)量控制，另一方面由于各機(jī)構(gòu)檢測能力參差不齊。不同機(jī)構(gòu)得到檢測數(shù)據(jù)的有效性和科學(xué)性也為監(jiān)管和公信帶來了新的問題。因此，制備標(biāo)準(zhǔn)樣品對檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行能力評定就顯得尤為重要。

本研究制備小鼠腎勻漿來源的ME-1和IDH-1標(biāo)準(zhǔn)樣品，并通過品系差異、凍融、時間溫度、運輸、濃度等因素對標(biāo)準(zhǔn)樣品的影響進(jìn)行研究，從而為近交系小鼠遺傳質(zhì)量控制檢測能力評定提供支持。

1 材料和方法

1.1 動物來源

BALB/c和C57BL/6小鼠各10只，8周齡雄性，購自中國食品藥品檢定研究院，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2017-0005；CBA小鼠10只，8周齡雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。本單位實驗動物使用許可證號SYXK(京)2017-0013。本實驗經(jīng)過中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利審查，倫理號：中檢動(福)第2019(A)001號。

1.2 儀器

Sartorius 酸度計(賽多利斯公司)，ML4002 電子天平(梅特勒托利多公司), Bead Ruptor 24 Eilte 樣品均質(zhì)儀(OMNI公司), Thermo Multifuge X1R 離心機(jī)(賽默飛世爾公司), LABCONACO 凍干機(jī)(labconco公司), 海爾BCD冰箱(青島海爾公司), Thermo恒溫箱(賽默飛世爾公司), BioRad 3000Xi 電泳儀(伯樂公司)、 微量點樣器(北京六一廠)。

1.3 試劑和耗材

滅菌手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司); Bead Ruptor 勻漿管(OMNI公司)、Greiner 凍存管(格瑞納公司)、凍存保護(hù)劑(西格瑪公司);三 羥甲基氨基甲烷與甘氨酸(北京中生瑞泰公司)、ME-1 和 IDH-1 染色試劑盒(本單位自行研制)、醋纖膜(浙江路橋公司)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

將3個品系實驗小鼠進(jìn)行CO2安樂死，并分別取腎臟置于燒杯中稱質(zhì)量，按照W(腎)∶V(水)=1∶2的比例，向Bead Ruptor勻漿管中加入遇冷蒸餾水，并置于Bead Ruptor 24 Eilte樣品均質(zhì)儀中按照腎勻漿程序勻漿。配平勻漿產(chǎn)物，置于4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心30 min，分品系分離上清至凍存管，按照7∶3比例加入凍存保護(hù)劑，置于凍干機(jī)凍干后于低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 均勻性測定程序

先將C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠腎勻漿按品系分組。按照4%的比例隨機(jī)抽取3個品系標(biāo)準(zhǔn)樣品，每管加入70 μL蒸餾水，混勻后取10 μL加入微量點樣器中，于Tris-Gly 8.5緩沖液浸潤的醋纖膜上點樣并電泳、染色，判讀條帶。緩沖液配置、具體實驗條件及判定標(biāo)準(zhǔn)參見GB/T 14927.1—2008 ME-1和IDH-1項目[6]。

如所得條帶均清晰可讀，且與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定一致，即認(rèn)為符合樣品的均勻性要求。如未通過均勻性檢測，則需重新制樣并檢測，直到符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

1.6 時間-溫度、凍融、運輸及濃度對標(biāo)準(zhǔn)樣品影響的測定

1.6.1凍融因素：三品系小鼠標(biāo)準(zhǔn)樣品各取3管，首次測定于-20 ℃冰箱中取出加水還原測定。實驗條件同均勻性測定實驗。所得條帶清晰可讀且與標(biāo)準(zhǔn)一致，則認(rèn)為一次凍融穩(wěn)定性良好。初次凍融后，即將試樣放入-20 ℃冰箱冷凍，每隔2 h再次取出，融化點樣測定。結(jié)果判讀依據(jù)與初次相同。過程中發(fā)生拖帶、彌散等情況，終止凍融測定并記錄測定次數(shù)。過程中一直穩(wěn)定，也以3次凍融為測定終點。

1.6.2時間-溫度因素：將C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠，以Cxx、Bxx和Axx進(jìn)行編組。制定一個21 d觀測計劃，統(tǒng)一在各溫度時間點放入待測標(biāo)準(zhǔn)樣品。將時間和溫度設(shè)為觀測的橫縱坐標(biāo)，設(shè)定4 ℃，室溫(RT)和37 ℃這3個溫度觀測點，1、2、3、7、14及21 d為觀測時間，在每個坐標(biāo)交點，每個型別的樣品分別隨機(jī)抽取兩瓶進(jìn)行編號，編號按照“品系-時間-溫度”原則。如C57BL/6的3 d、37 ℃樣品，分別標(biāo)為C-3-37-1和C-3-37-2。

在取出當(dāng)天進(jìn)行檢測。所得條帶清晰可讀且與標(biāo)準(zhǔn)一致，則認(rèn)為該溫度時間坐標(biāo)點穩(wěn)定性良好；所得條帶中任何1條發(fā)生條帶模糊不可讀，則認(rèn)為在該坐標(biāo)點已經(jīng)發(fā)生了樣品的穩(wěn)定性變化，記錄不穩(wěn)定坐標(biāo)點，且不穩(wěn)定點出現(xiàn)后的時間溫度觀測點隨之取消。即使一直穩(wěn)定，本測定的觀測周期也僅為21 d時長。

匯總各型別穩(wěn)定性結(jié)果，填寫時間-溫度穩(wěn)定性表格。

1.6.3運輸因素：運輸條件每品系兩管，干冰條件冷鏈，北京至沈陽、西安及成都三地往返測試。檢測實驗條件同均勻性測定實驗。條帶清晰可判讀，則認(rèn)為運輸對穩(wěn)定性無影響；否則，需要重新調(diào)整運輸條件重新測試。

1.6.4濃度因素：濃度因素按照每品系一管進(jìn)行原倍、1/2、1/4和1/8梯度測試。測試條件同均勻性測定實驗1.5。條帶清晰可判讀，則認(rèn)為該濃度對穩(wěn)定性無影響；條帶不可見，則認(rèn)為該濃度對穩(wěn)定性有影響。

2 結(jié)果

2.1 均勻性測定結(jié)果

C57BL/6、BALB/c和CBA三組樣品按照4%的比例分別抽取8管、8管和6管。ME-1均勻性檢測中C57BL/6和CBA組均為b型，BALB/c組為a型。IDH-1均勻性檢測中，C57BL/6和BALB/c組均為a型，CBA組為b型，且與GB/T 14927.1—2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定一致(圖1)，隨機(jī)抽樣組內(nèi)無差別。其中C57BL/6、BALB/c和CBA標(biāo)準(zhǔn)品，以下簡稱C5標(biāo)、BA標(biāo)和CB標(biāo)。

圖1 實驗小鼠腎勻漿中ME-1和IDH-1均勻性檢測結(jié)果Fig.1 Uniformity sampling results of ME-1 and IDH-1

2.2 凍融穩(wěn)定性結(jié)果

經(jīng)1～3次凍融檢驗，C57BL/6、BALB/c和CBA三組樣品的IDH-1仍清晰可判讀，與初次凍融一致。

ME-1第3次凍融結(jié)果較前兩次結(jié)果，條帶變淡但肉眼可讀，綜合判定為3次凍融對結(jié)果判別無影響(圖2)。

圖2 CBA ME-1和IDH-1的3次凍融結(jié)果Fig.2 Three-time freeze thawing stability results of ME-1 and IDH-1 in CBA

2.3 時間-溫度因素對穩(wěn)定性影響的測定

存放穩(wěn)定性觀察期最長21 d。經(jīng)實驗測定表明，三品系來源的標(biāo)準(zhǔn)樣品在4 ℃和室溫條件下，均可以穩(wěn)定存放21 d。在37 ℃條件下，僅能穩(wěn)定存放2 d，第3天開始降解(圖3)，ME-1和IDH-1均出現(xiàn)拖帶，帶型和第2天和標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果均有差異，已不可讀。

圖3 BALB/c ME-1和IDH-1 第2～3天37 ℃檢測結(jié)果Fig.3 Results of the ME-1 and IDH-1 in BALB/c from the 2nd to 3rd day under 37 ℃

三品系不同個體和不同型別之間沒有顯著差異，時間-溫度存放穩(wěn)定性匯總結(jié)果見表1。

表1 實驗小鼠腎勻漿中ME-1和IDH-1樣品不同溫度時間穩(wěn)定性結(jié)果Table 1 Results of ME-1 and IDH-1 stability under different time and temperature condition

2.4 運輸因素對穩(wěn)定性影響的測定

經(jīng)實驗測定表明，三品系來源樣品經(jīng)在低溫系統(tǒng)運輸往返西安、成都和沈陽，均能穩(wěn)定存在。圖4為北京往返西安后的測定結(jié)果。

圖4 北京-西安往返運輸穩(wěn)定性檢測結(jié)果Fig.4 Transpotation stability results of ME-1 and IDH-1 from Beijing to Xi’an

2.5 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定結(jié)果

C57BL/6、BALB/c和CBA三種樣品各抽一管，按照原倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍進(jìn)行梯度稀釋后，蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1各濃度測定結(jié)果和原倍一致，且均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。1/8倍稀釋，對樣品穩(wěn)定性無明顯影響。圖5給出了C57BL/6樣品組各濃度梯度的檢測結(jié)果。

圖5 C57BL/6 樣品ME-1和IDH-1濃度梯度結(jié)果Fig.5 Concentration gradient results of ME-1 and IDH-1 in C57BL/6 mice

3 討論

作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要屬性的均勻性和穩(wěn)定性受到抽樣方法、測量環(huán)境、評價方法等多種因素的影響[7-9]。探討不同因素對標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性和穩(wěn)定性的作用，以期更為合理的進(jìn)行檢測評價。

3.1 不同品系來源標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

C57BL/6、BALB/c和CBA是近交系小鼠應(yīng)用和檢測中最為常見的品系。不同來源腎勻漿樣品的帶型顯色濃度略有差異，C57BL/6和BALB/c來源的ME-1比CBA來源的樣品顯色更清晰，而在IDH-1位點上，3個來源樣品無明顯差異。如果僅制備用以區(qū)分兩位點的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從動物福利角度，可以僅選用C57BL/6和CBA品系即可。從檢測角度而言，應(yīng)當(dāng)熟悉常用品系的表型。

3.2 凍融、時間-溫度、運輸和濃度對樣品穩(wěn)定性的影響

本研究探討了4種變量因素對樣品穩(wěn)定性的影響。北京往返沈陽、西安、成都三地約1 400、2 200和3 600 km，運輸條件為干冰，往返時間為2～5 d。收取樣品時，成都往返樣品干冰已無剩余，但樣品并表觀未改變。因此說明非全程低溫長途運輸對兩位點標(biāo)準(zhǔn)樣品無明顯影響。同時，3次凍融以及1/8倍稀釋對標(biāo)準(zhǔn)樣品在ME-1和IDH-1位點穩(wěn)定性均無影響，但長時間高溫狀態(tài)對樣品影響明顯。室溫和4 ℃條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品21 d內(nèi)均能穩(wěn)定存在，但在37 ℃條件下僅能穩(wěn)定存在2 d，耐高溫能力介于酯酶-3(37 ℃、1 d)和過氧化氫酶-2(37 ℃、30 d)之間[10-11]。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方案的設(shè)計和改進(jìn)

本研究從檢測常用角度，選取3種品系來源小鼠制備了ME-1和IDH-1標(biāo)準(zhǔn)樣品。在兩位點上，綜合表現(xiàn)為3種帶型，進(jìn)行能力驗證計劃樣品發(fā)放時，可以隨機(jī)發(fā)放2～3種樣品，形成不同的組合結(jié)果。既兼顧了難度和公平，又能夠更好地防止結(jié)果串通，有利于反應(yīng)參與者的真實檢測水平。

樣品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性。除非37 ℃高溫暴露2 d以上會出現(xiàn)不穩(wěn)定結(jié)果。在室溫(約25 ℃)及以下溫度條件可穩(wěn)定存在21 d。3次凍融且距離在3 600 km以內(nèi)的干冰運輸方式對1/8倍稀釋樣品的均勻性和穩(wěn)定性均沒有顯著影響。下一步，將完善在-20 ℃的低溫條件下，長期保存的穩(wěn)定性研究，從而為標(biāo)準(zhǔn)樣品研制、能力驗證計劃以及測量審核實施提供有力的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。