孫紅爽 李鵬霖 劉永雙 乜春城 種寶貴

(哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院藥學(xué)部，衡水 053000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜合征的主要臨床表現(xiàn)之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但“二次打擊”理論已被普遍認(rèn)同，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝紊亂在其發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[2]。大黃素(emodin)是中藥材大黃的主要有效單體組分，可從大黃、虎杖、決明子、何首烏和蘆薈等中藥材中有效提取。大黃素具有多種藥理作用，主要包括抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)肝細(xì)胞、抗腫瘤等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以改善高脂飼料喂養(yǎng)大鼠非酒精性脂肪肝及脂質(zhì)代謝紊亂[4]。本次研究通過高熱量飼料喂養(yǎng)建立NAFLD大鼠模型，觀察大黃素對高熱量飼料喂養(yǎng)所致大鼠NAFLD的治療作用并探討其作用機(jī)制，為NAFLD的藥物治療和發(fā)病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購自河南實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥理教研室【SYXK(蘇)2018-0018】；適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(2018-3-015)。

1.2 試劑與儀器

大黃素(鄭州荔諾生物科技有限公司，批號：160724，純度98%)，全自動生化分析儀(日立公司，7600-020)，兩步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；11β-HSD1抗體(Santa Cruz公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(MJ Research 公司)；Western blot儀(Bio-Rad公司)。

1.3 動物分組與給藥

40只大鼠隨機(jī)分為：對照組、模型組、大黃素低劑量組(E1組)、大黃素高劑量組(E2組)，每組10只。對照組給予普通飼料，其他3組給予自制高熱量飼料(配方：22%豬油+8%糖+2%膽固醇+2%食鹽+66%基礎(chǔ)飼料)，飲用自來水。第9周開始，E1組、E2組每天分別灌胃給以大黃素30 mg/kg和60 mg/kg(用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液提前配制，濃度10 mg/mL)，對照組和模型組灌胃給以相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天給藥1次，連續(xù)6周。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1一般觀察：每周記錄大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量，觀察動物皮毛光澤度、糞便及活動情況。

1.4.2肝指數(shù)的測定：大鼠麻醉后頸動脈插管取血，血樣1 370 r/min離心10 min，分離血清，于-20 ℃保存待測。打開腹腔，取完整肝組織，反復(fù)漂洗后稱重，并計(jì)算肝指數(shù)(hepatic index, HI)：HI(mg/g)=肝臟重量(g)/體質(zhì)量(g)×1 000。

1.4.3血液指標(biāo)測定：采用全自動生化分析儀檢測血清中的血糖、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、游離脂肪酸(free fatty acid, FFA) 及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alaninne aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。采用DFM-96型16管放射γ免疫計(jì)數(shù)器檢測血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和胰島素。并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=(空腹胰島素×空腹血糖)/22.5。

1.4.4肝組織生化指標(biāo)測定：取新鮮肝組織200 mg肝組織，制成10%的肝組織勻漿，1 370 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存。用于測定肝組織TC、TG、FFA及TNF-α含量，檢測方法同血液指標(biāo)測定。

1.4.6肝組織11β- HSD1蛋白表達(dá)：取適量肝組織，提取組織蛋白進(jìn)行Western blot檢測。14.7%分離膠、5%濃縮膠，60V電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉2 h，以兔抗小鼠11β-HSD1多克隆抗體為一抗(1∶200 稀釋)4 ℃過夜，以羊抗兔IgG-HRP抗體為二抗(1∶800稀釋)室溫作用2 h，ECL檢測。實(shí)驗(yàn)所得條帶，在Bandscan分析軟件中測得各自的總灰度值，進(jìn)行定量分析，并用自身β-actin灰度值校正。

1.4.7肝組織病理學(xué)檢查：取適量新鮮肝臟，甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，切片，蘇木精-伊紅染色法(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。參考非酒精性脂肪性肝炎(NASH)臨床研究評分系統(tǒng)[5]，評價(jià)肝組織病變情況，即：脂肪變性(0～3分)、小葉炎癥(0～3分)、匯管區(qū)炎癥(0～1分)、肝細(xì)胞氣球樣變(0～2分)和肝組織纖維化(0～4分)，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 NASH評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 NASH clinical research network scoring system

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對照組食欲良好，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，大便呈顆粒狀、黃而質(zhì)硬，皮毛整潔，行動敏捷。模型組食欲減退，肥胖，大便呈顆粒狀、黑而質(zhì)硬，毛色發(fā)黃且蓬亂，行動遲緩。與模型組比較，E1組體質(zhì)量較模型組下降，大便質(zhì)軟，皮毛微黃；E2組體質(zhì)量下降更為明顯，大便質(zhì)稀、不成形，皮毛微黃，行動較敏捷。

2.2 肝指數(shù)

各組大鼠肝指數(shù)檢測結(jié)果見圖1。與對照組比較，模型組及E1組肝指數(shù)顯著增大(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，E1組及E2組肝指數(shù)均有下將趨勢，但只有E2組有顯著差異(P<0.05)。

注：*P<0.05,**P<0.01，與對照組比較；#P<0.05，與模型組比較Note:*P<0.05,**P<0.01, compared with control group;#P<0.05, compared with model group圖1 各組大鼠肝指數(shù)Fig.1 Hepatic index (HI) in wistar rats

2.3 血液生化指標(biāo)

肝功能、血糖、血脂、胰島素及TNF-α檢測結(jié)果見表2。與對照組比較，模型組大鼠AST、ALT、血糖、血脂、胰島素及炎性因子TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，E1組和E2組以上各項(xiàng)指標(biāo)均有好轉(zhuǎn)趨勢，且E2組變化更為顯著(P<0.01或P<0.05)。說明模型組動物出現(xiàn)血糖、血脂紊亂，肝功能異常及炎性反應(yīng)，而大黃素治療可有效改善以上病變，且高劑量組效果更明顯。同時(shí)HOMA-IR與胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果很好吻合。

表2 各組大鼠血液生化指標(biāo)結(jié)果Table 2 The serum parameters of wistar rats n=10)

2.4 肝指數(shù)及肝臟生化指標(biāo)

肝指數(shù)、肝組織脂質(zhì)沉積及TNF-α含量檢測結(jié)果見表3。與對照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)顯著增大，出現(xiàn)明顯的肝脂質(zhì)沉積，且肝TNF-α含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，E1組和E2組以上各項(xiàng)指標(biāo)均有下降趨勢，且以E2組下降更為顯著(P<0.01或P<0.05)。

表3 各組大鼠肝生化指標(biāo)結(jié)果Table 3 The hepatic tissue biochemical parameters of wistar rats n=10)

2.5 肝組織11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)

與對照組比較，模型組和E1組肝組織11β-HSD1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高 (P<0.01)；與模型組比較，E1組和E2組肝組織11β-HSD1 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且E2組變化更為顯著，結(jié)果見圖2。

注：A：肝組織11β-HSD1基因表達(dá)結(jié)果；B：肝組織11β-HSD1蛋白表達(dá)結(jié)果；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01Note: A: The expression of 11β-HSD1 mRNA in liver; B: Western blot analysis of 11β-HSD1 in liver; Compared with control group,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01圖2 各組肝組織11β-HSD1基因及蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 The expression of 11β-HSD1 mRNA and protein in liver of wistar rats

2.6 肝組織切片

肝組織切片顯示：對照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝小葉輪廓清晰，所有動物均未顯示脂肪變性及炎性反應(yīng)；模型組大鼠脂肪變性明顯，可見匯管區(qū)炎性反應(yīng)，并伴有輕度或中度肝細(xì)胞氣球樣變，部分發(fā)現(xiàn)肝組織纖維化；E1組大鼠脂肪變性程度減輕，部分發(fā)現(xiàn)匯管區(qū)炎性反應(yīng)及輕度肝細(xì)胞氣球樣變，個(gè)別肝組織纖維化；E2組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，個(gè)別出現(xiàn)輕度脂肪變性、匯管區(qū)炎性反應(yīng)及肝細(xì)胞氣球樣變，未見肝組織纖維化。典型肝組織切片見圖3。

注：A：對照組；B：模型組；C：E1組；D：E2組Note: A: the control group; B: the model group; C: the E1 group; D: the E2 group圖3 大鼠肝病理切片F(xiàn)ig.3 Representative histopathological ndings in the liver of wistar rats (HE, ×200)

3 討論

NAFLD是代謝綜合征疾病譜中的重要一員，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但現(xiàn)已證實(shí)其發(fā)病過程與胰島素抵抗密切相關(guān)。截至目前，并沒有針對NAFLD的特效治療藥物，多采用改善飲食結(jié)構(gòu)、運(yùn)動等行為方式改變，結(jié)合降脂藥物、胰島素增敏劑、抗氧化劑、保肝藥物等對癥治療[6-7]。

大黃是我國傳統(tǒng)中藥材，具有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效。大黃素是中藥大黃的主要活性成分，屬游離型蒽醌類衍生物，具有瀉下、抗感染、抗菌、抗病毒、降脂、降壓和抗腫瘤等作用[8-9]。近年來，大黃素用于治療糖尿病、脂肪肝的報(bào)道日益增多，研究顯示其在改善糖脂代謝、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、肝臟脂質(zhì)沉積等方面具有顯著作用[10]，有學(xué)者認(rèn)為這可能與其抑制炎性反應(yīng)有關(guān)[11]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以明顯改善胰島素抵抗大鼠的糖脂代謝水平和胰島素敏感性，抑制11β-HSDl基因及蛋白表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一[12]。

11β-HSD1是一種低親和力、NADPH依賴的微粒體酶，在體內(nèi)可以催化無活性的 17-羥-11脫氫皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化成具活性的皮質(zhì)醇，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平來發(fā)揮生理效應(yīng)[13]。11β-HSDl與代謝綜合征、2型糖尿病密切相關(guān)，11β-HSDl基因敲除可改善胰島素抵抗，11β-HSDl抑制劑可有類似效果。目前已知的天然 11β-HSD1 抑制劑主要包括：膽汁酸、孕激素的代謝產(chǎn)物、黃酮/羥基黃酮、生胃酮、大黃素、姜黃素以及越南割舌樹提取物cochinchinoid K等[14]。另外，許多研究者通過改變已知11β-HSD1 抑制劑的結(jié)構(gòu)，人工合成了許多11β-HSD1 抑制劑，如BVT2733、INCB013739、MK0916、PF-915275等[15]。11β-HSD1 作為一個(gè)新的靶點(diǎn)已經(jīng)成為近年來創(chuàng)新藥物研究的熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素可以通過選擇性的抑制11β-HSD1活性，降低空腹血糖水平，增加糖耐量，增加胰島素敏感性，有效改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[16-17]，這與本研究前期研究一致。

本次研究結(jié)果顯示，大黃素治療能夠顯著改善高熱量飼料喂養(yǎng)所致大鼠NAFLD，表現(xiàn)為：降低肝指數(shù)，改善肝功能，降低血脂及肝脂質(zhì)沉積，減少炎性因子的釋放。肝組織切片觀察結(jié)果與指標(biāo)檢測結(jié)果吻合，大黃素治療組肝脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變、匯管區(qū)炎性反應(yīng)、纖維化等NAFLD病理改變均有不同程度的改善。并且，大黃素高劑量組較大黃素低劑量組治療效果更為明顯，說明大黃素對NAFLD的治療作用呈劑量依賴性。同時(shí)，大黃素可有效抑制胰島素抵抗及肝組織內(nèi)的11β-HSD1基因和蛋白表達(dá)量。推測，大黃素通過抑制體內(nèi)11β-HSD1活性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，進(jìn)而發(fā)揮對NAFLD的治療作用。