黃瑞玲, 何 晴, 陸芍華, 嚴夢涵, 許麗惠, 王全溪, 黃翠琴, 黃其春[1.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室(福建農(nóng)林大學)，福建 福州 50002;2.中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 50002；.福建省家畜傳染病與生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 64012]

雞感染Ⅰ群禽腺病毒4型(Fowladenovirusserotype 4, FAdV-4)后可引起肝炎—心包積液綜合征(HHS)[1].1987年該病首次發(fā)生在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)，隨后在許多地區(qū)廣泛流行起來[2-4].家禽易感染FAdV-4，急性感染后主要出現(xiàn)肌胃糜爛、包涵體肝炎和心包積液等癥狀.2015年以前，對雞群危害較大的是感染FAdV-4導致的包涵體肝炎.在研究其致病機制的過程中發(fā)現(xiàn)，當FAdV-4感染機體細胞時，其纖維蛋白表面上的突起與細胞膜接觸，然后進入細胞漿內(nèi)進行蛋白的合成，隨后病毒核酸轉(zhuǎn)移至細胞核進行病毒的復制并裝配成病毒粒子，當宿主細胞崩解時，新的病毒產(chǎn)生，故肝細胞核內(nèi)?？梢姷讲《景w[1,5].目前，可以采取觀察內(nèi)包涵體、免疫熒光檢測抗原等檢測方法實現(xiàn)對禽腺病毒DNA的有效檢測與鑒定[6].病毒分離鑒定、PCR反應(yīng)及測序分析、瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗等病原學和血清學方法是FAdV-4鑒定及感染診斷的常用方法[7-9]，然而對感染FAdV-4后病雞外周血細胞、主要血液生化指標的研究并不豐富.近年來，該病則表現(xiàn)出更為嚴重的肝炎—心包積液綜合征，并對全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，急需對該病的致病機制做進一步深入研究.

近年來，國內(nèi)外對機體外周血炎癥因子的探究已十分完善.如：孫培靜等[10]研究表明，外周血免疫球蛋白E(IgE)、補體C3和C4的水平與肥胖型支氣管哮喘患兒病情嚴重程度及肺功能呈正相關(guān)；詹奇等[11]研究表明，在機體感染丙型肝炎病毒(HCV)后的不同時期，都會提高外周血中白介素-2R(IL-2R)和γ-干擾素(IFN-γ)的水平；袁健生等[12]研究表明，感染紅斑狼瘡后，患者外周血中的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)水平均提高.然而，F(xiàn)AdV-4感染后對機體外周血炎癥因子的影響尚不明確，需進一步探明.

多種病毒感染后，對機體外周血中的免疫球蛋白、炎癥因子和血細胞均有影響.禽腺病毒感染導致嚴重的心包炎和肝炎，其致病機制仍有許多需要進一步闡明.本研究主要從外周血角度，探究FAdV-4感染對雞外周血細胞、主要血液生化指標和炎癥因子的影響，旨在為FAdV-4致病機理的進一步研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和病毒毒株 供試30只28日齡白羽肉雞經(jīng)PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ezyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測為FAdV-4抗原、抗體雙陰性.FAdV-4 NP株由本實驗室分離鑒定并保存[13-14]，其半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(tissue culture infective dose, TCID50)=10-4.625·mL-1.

1.1.2 主要試劑 普通真空采血管、EDTA-K2真空采集管、頭皮針等購自蘭博利德有限公司；血常規(guī)檢測試劑盒、血液生化檢測盒、血液炎癥因子ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒購自Promega公司.

1.2 血液樣品的制備

將30只供試雞隨機分為兩組，每組3個重復，每個重復5只.試驗開始時，試驗組每只雞肌肉注射0.5 mL FAdV-4 NP株病毒(TCID50=10-4.625·mL-1)，對照組每只雞肌肉注射等量的滅菌生理鹽水.于感染3、6、12、24 h時，從每個重復中各取1只雞，采集抗凝和非抗凝外周血.用分離血清后的非抗凝血檢測血液生化指標和炎癥因子；用抗凝血檢測血細胞和病毒載量.

1.3 指標檢測

1.3.1 病毒載量的檢測 按照病毒RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組病毒RNA樣本，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進行反轉(zhuǎn)錄[15].合成的cDNA保存在-20 ℃.按照SYBR熒光定量試劑盒說明書的步驟進行熒光定量PCR擴增.反應(yīng)體系20 μL：10 μL Mix，7.9 μL ddH2O，上、下游引物各0.6 μL，1.5 μL cDNA.qPCR的擴增條件為兩步法：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 5 s，循環(huán)40次.以β-actin為內(nèi)參基因，采用陳媛等[15]的方法計算基因表達量.引物由上海生工生物技術(shù)公司合成[13].引物信息如表1所示.

表1 熒光定量PCR相關(guān)引物序列

1.3.2 血細胞的檢測 用抗凝血液檢測血細胞，檢測指標有白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板數(shù).采用全自動血液細胞分析儀檢測.

1.3.3 血液生化指標的檢測 將普通真空采血管中的血液移至EP管中，待血液凝固后，于3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，棄去沉淀.用分離的血清檢測血液生化指標，檢測指標有血糖、甘油三酯、總蛋白等水平.采用全自動血液生化分析儀檢測.

1.3.4 血液炎癥因子的檢測 檢測的炎癥因子有人高遷移率族蛋白B1(human high-mobility group box-1, HMGB1)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、組胺、緩激肽、P物質(zhì)等水平.按照TransZol Up Plus RNA試劑盒說明書的步驟提取血液總RNA，按照GoScriptTMReverse反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-qPCR檢測炎癥因子的水平[13,15].

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行獨立樣本t檢驗，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 FAdV4感染對雞外周血細胞病毒載量的影響

3～24 h時,被FAdV-4感染的時間越長，雞外周血細胞病毒載量越高，二者呈正相關(guān)(圖1).

圖1 FAdV-4感染對雞外周血細胞病毒載量的影響

2.2 FAdV-4感染對雞外周血細胞的影響

圖2顯示，與未攻毒組相比，隨著被FAdV-4感染的時間越長，雞外周血細胞中的紅細胞數(shù)相應(yīng)減少，而白細胞數(shù)則相應(yīng)增加.感染3 h時，白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)；感染6、12、24 h時，白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).紅細胞數(shù)與感染時間呈負相關(guān)，而白細胞數(shù)與感染時間呈正相關(guān).感染3、6 h時，雞外周血細胞中的血小板數(shù)與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染12、24 h時的血小板數(shù)增加，尤其在12 h時增加最多，與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.3 FAdV-4感染對雞外周血液生化指標的影響

圖3顯示：與未攻毒組相比，感染FAdV-4 3～24 h，雞外周血液中的血糖濃度顯著升高(P<0.05)，甘油三酯濃度顯著下降(P<0.05)，總蛋白含量也減少；總蛋白含量在被FAdV-4感染3、12 h時與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染6、24 h時與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.4 FAdV-4感染對雞外周血炎癥因子的影響

圖4顯示：感染FAdV-4 3、6、12 h時，雞外周血液中的HMGB1含量與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染24 h時顯著增加(P<0.05)；感染3～24 h時，IL-1β、組胺和緩激肽的含量較未攻毒組顯著增加(P<0.05)；感染6 h時，IL-6和P物質(zhì)的含量與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染3、12、24 h時，IL-6和P物質(zhì)的含量均顯著增加(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

2015年后，全球陸續(xù)報道雞發(fā)生嚴重的肝炎—心包積液綜合征，經(jīng)證實病原為FAdV-4，與雞包涵體肝炎不同的是，肝炎—心包積液綜合征導致3～5周齡雞心包腔產(chǎn)生大量的黃色膠凍狀滲出液，肝臟有大量出血點，肝炎嚴重，肝細胞變性壞死，肝血竇擴張，出現(xiàn)嗜堿性包涵體[1].目前，F(xiàn)AdV-4的致病機理尚未完全明確.

血常規(guī)包括紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)和血小板計數(shù)等.血常規(guī)檢查首先可以確定機體是否存在炎癥、貧血以及是否存在血小板數(shù)減少或者增加的現(xiàn)象，初步判定機體出血是否與血小板有關(guān)[16].本研究結(jié)果表明：感染FAdV-4后，雞外周血細胞病毒載量與感染時間呈正相關(guān)；紅細胞數(shù)隨著病毒載量的增加而減少，說明感染FAdV-4后機體有出血或失血現(xiàn)象，此結(jié)果與臨床病理剖檢結(jié)果[13]一致.由于雞感染FAdV-4后有出血癥狀，導致外周血紅細胞數(shù)減少[17]，雞呈明顯的貧血狀態(tài).雞感染FAdV-4后，其肝臟發(fā)生嚴重的出血病變，肝臟病變會影響機體的凝血功能，導致外周血小板數(shù)增加，使外周血液處于高凝狀態(tài)；此外，趙麗紅[18]研究表明，“肝藏血”功能異常會導致肝炎患者血紅細胞數(shù)下降.本研究結(jié)果顯示，感染FAdV-4后，雞外周血白細胞數(shù)與病毒載量呈正相關(guān)，表明炎癥細胞顯著增加，此結(jié)果與國紀壘[19]的研究結(jié)果“FAV-1攻毒后的24 h內(nèi)白細胞數(shù)高于對照組”一致.唐迎元等[20]研究表明，兒童感染重癥腺病毒肺炎后，外周血白細胞數(shù)和血小板數(shù)增加.有些病毒的感染也會導致機體發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，從而對機體造成損傷[17-20].

血液中的總蛋白、血糖、甘油三酯水平可以初步判定機體肝臟功能[21].研究表明，新冠病毒導致感染者血糖濃度升高，與糖尿病關(guān)系密切[22].由于新冠病毒會直接破壞胰腺進而破壞胰島細胞[22]，可能引起炎癥因子發(fā)生改變從而導致機體腎上腺素等分泌增加，產(chǎn)生胰島素抵抗，血糖濃度升高[22].糖皮質(zhì)激素通過抗炎作用阻斷炎癥瀑布反應(yīng)，作為胰島素對抗激素，引起血糖濃度升高[22].由此猜想，F(xiàn)AdV-4感染是否與新冠病毒感染相同，通過破壞胰腺進而引起血糖濃度升高需要進一步探究.此外，牛玉娟[23]研究表明，感染FAdV-4 1 d后，雞血糖濃度升高，此結(jié)果與本研究結(jié)果一致.由于肝臟是血糖代謝的主要器官，感染FAdV-4后，雞肝臟功能被破壞，從而導致血糖降解能力減弱，出現(xiàn)血糖濃度升高的現(xiàn)象.本研究結(jié)果同樣表明，感染FAdV-4后，雞血糖濃度顯著升高，可能與肝臟損傷有關(guān).

外周血總蛋白含量減少常見于機體由于肝細胞病癥或肝功能受損而引起的蛋白合成障礙.如：徐亞林等[24]研究表明，新冠肺炎明顯損傷患者的肝功能，其中，總蛋白對于肝功能損傷具有一定程度的診斷價值；本研究結(jié)果表明，雞感染FAdV-4后，病禽的肝臟呈現(xiàn)嚴重出血的病理癥狀，導致總蛋白合成障礙，外周血總蛋白含量減少；李碩[25]研究表明，甘油三酯濃度下降可能是雞患有嚴重的肝病或者機體代謝異常所導致的.本研究中，雞感染FAdV-4后，肝臟受損嚴重從而導致機體代謝紊亂，可能是甘油三酯濃度下降的原因.

HMGB1主要的作用是可以激活肥大細胞從而導致中樞炎癥[26].IL-6是活化的T細胞以及成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，它的主要功能是能使B細胞前體產(chǎn)生抗體，還能與集落刺激因子協(xié)同促進原始骨髓源細胞的生長和分化，進一步增強自然殺傷細胞的裂解功能[27].HMGB1和IL-6含量的增加可以說明雞感染FAdV-4后機體炎癥因子釋放明顯[26-27].IL-1β作為內(nèi)皮細胞活化因子，其主要的作用是在機體炎癥產(chǎn)生的前期誘導單核—吞噬細胞的產(chǎn)生[26-27].湯正珍[28]研究表明，小鼠感染HAdV-7 24 h后，HMGB1的表達量顯著增加.細胞外的HMGB1與Toll樣受體、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體相結(jié)合從而促使NF-kB通路被激活，進一步促進致炎細胞因子IL-6、IL-1β基因表達水平的上調(diào)，促進炎癥的產(chǎn)生[29].組胺是一種活性胺化合物，是機體中的一種化學傳導物質(zhì)，對許多細胞的反應(yīng)均有影響，其中就包括過敏反應(yīng)和炎性反應(yīng)[27].馬衛(wèi)紅等[30]研究表明，雞、鴨外周血中的組胺含量在感染病毒后均顯著升高，表明低致病性H9N2禽流感病毒可引起禽類產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并導致組胺含量升高.緩激肽可以提高心肌缺血早期三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸的含量，使糖原分解減少，乳酸生成下降，從而提高心肌的抗缺血能力[26].P物質(zhì)在細神經(jīng)纖維中廣泛分布，逆向電刺激感覺神經(jīng)或經(jīng)細傳入神經(jīng)傳出的軸突反射和背根反射沖動可使外周端末稍釋放P物質(zhì)，引起神經(jīng)支配區(qū)血管擴張、通透性增強、血漿蛋白外滲等神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)[31].P物質(zhì)是傷害性信息初級傳入的神經(jīng)遞質(zhì)，與許多炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子相互作用，誘導產(chǎn)生多種細胞因子，從而促進單核細胞分泌 IL-1、IL-6等炎癥因子[31].本研究結(jié)果表明，雞感染FAdV-4后導致外周血多種炎癥因子顯著增加，說明與上述前人的研究結(jié)果一致，機體感染病毒后均會產(chǎn)生嚴重的炎癥反應(yīng).