曾 麗, 蔡旭濱, 李 健, 吳樟強(qiáng), 黃一帆, 馬玉芳

[1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))，福建 福州 350002；3.福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司，福建 龍巖 364000]

仔豬早期斷奶技術(shù)因其可提高母豬的生產(chǎn)性能而在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但早期斷奶會(huì)導(dǎo)致仔豬胃腸功能紊亂及生長(zhǎng)性能下降等問(wèn)題，主要表現(xiàn)為腸絨毛萎縮、免疫力降低、生長(zhǎng)緩慢、腹瀉等[1-2].臨床上主要通過(guò)添加抗生素及高劑量微量元素等進(jìn)行預(yù)防和治療，與此同時(shí)也產(chǎn)生抗生素殘留、腸道菌群紊亂以及細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)等問(wèn)題[3].在減抗、禁抗的時(shí)代背景下，植物精油作為一種綠色環(huán)保、安全無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)的原料獲得國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注，成為替抗的研究熱點(diǎn)之一[4].牛至油是從植物牛至(OriganumvulgareL.)中提取的植物精油，抗菌、抗氧化、促生長(zhǎng)、提高免疫力等已是其被證實(shí)所具有的功能，同時(shí)也是一種潛在的抗生素替代物和促生長(zhǎng)劑[5-8].研究表明，牛至油可提高動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶活性和清除體內(nèi)氧自由基的能力，從而加強(qiáng)抗氧化作用[8].本課題組前期研究表明，牛至油能通過(guò)提高斷奶仔豬IGF-Ⅰ等相關(guān)激素水平，進(jìn)而促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)[9].但關(guān)于牛至油對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能、免疫功能及血常規(guī)、血清生化指標(biāo)的影響則鮮見(jiàn)報(bào)道.本研究擬在基礎(chǔ)日糧中添加牛至油，研究牛至油對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能、免疫功能、血清生化指標(biāo)和血常規(guī)的影響，旨在為牛至油在斷奶仔豬中的應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

120頭25日齡斷奶的“大白×長(zhǎng)白”二元雜交仔豬來(lái)源于福建省莆田市優(yōu)利可農(nóng)牧發(fā)展有限公司.

半包被的10%牛至油預(yù)混劑，主要成分為香芹酚、百里香酚(各占5%)，包被材料為輕質(zhì)碳酸鈣[9]，購(gòu)自福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司.

1.2 試驗(yàn)分組

按公母各半、體重相近的原則將120頭仔豬隨機(jī)分為CK及A、B、C試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬.CK及A、B、C試驗(yàn)組分別飼喂添加0、300、500、800 mg·kg-1牛至油的基礎(chǔ)日糧，預(yù)試期5 d，正試期30 d[9].

1.3 日糧配方與飼養(yǎng)管理

日糧參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]的方法配制.飼養(yǎng)管理和免疫程序按照常規(guī)進(jìn)行.

1.4 血樣的采集與處理

試驗(yàn)第15、30天時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取體重中等的3頭仔豬空腹前腔靜脈采血.取2 mL血液置于EDTA-K2抗凝管中，用于血常規(guī)測(cè)定；取5～6 mL血液置于10 mL離心管中，于3 000 r·min-1離心10 min，收集血清，用Eppendorf管分裝，置-20 ℃保存，用于血清抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)和生化指標(biāo)的測(cè)定.

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 采用Fe3+還原法測(cè)定總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，采用比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde, MDA)濃度.測(cè)試儀器為V-1200型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所.

1.5.2 血清免疫球蛋白和補(bǔ)體含量的測(cè)定 采用免疫比濁法測(cè)定免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)和補(bǔ)體(C3、C4)的含量.測(cè)試儀器為RT-9900半自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司.

1.5.3 血清細(xì)胞因子含量的測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定血清細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)含量.測(cè)試儀器為BIO-RAD酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所.

1.5.4 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 甘油三酯、總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等水平由福州空軍醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助檢測(cè).總蛋白含量與白蛋白含量的差值為球蛋白含量.測(cè)定儀器為OLYMPUS AU2700型全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀(OLYMPUS 公司).

1.5.5 血常規(guī)的測(cè)定 紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、血小板含量、淋巴細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞數(shù)、血小板分布寬度、平均血小板體積、血小板數(shù)由福州空軍醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助檢測(cè)，測(cè)定儀器為T(mén)-2100型全血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(日本希森美康公司).

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至油對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響

由表1可知：試驗(yàn)第15、30天時(shí)，與CK相比， 3個(gè)試驗(yàn)組斷奶仔豬的T-AOC、SOD活性顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)，MDA濃度極顯著降低(P<0.01)；GSH-Px活性與CK相比均有一定程度的提高，但差異不顯著(P>0.05).

表1 牛至油對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響1)

2.2 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白和補(bǔ)體含量的影響

由表2可知：試驗(yàn)第15 天時(shí)，相比CK，3個(gè)試驗(yàn)組斷奶仔豬的IgA、IgM、IgG、C3含量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；C4含量與CK相比均有一定程度的提高，但差異不顯著(P>0.05).試驗(yàn)第30天時(shí)，相比CK，3個(gè)試驗(yàn)組的IgA、IgM、IgG、C3、C4含量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01).

表2 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白和補(bǔ)體含量的影響1)

2.3 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響

由表3可知：試驗(yàn)第15天時(shí)，與CK相比，3個(gè)試驗(yàn)組斷奶仔豬的IFN-γ含量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；IL-2、IL-6含量與CK相比均有一定程度的提高，但差異不顯著(P>0.05).試驗(yàn)第30天時(shí)，與CK相比，3個(gè)試驗(yàn)組的IL-2 、IL-6、IFN-γ含量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01).

表3 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響1)

2.4 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表4、表5可知：試驗(yàn)第15天時(shí)，與CK相比，3個(gè)試驗(yàn)組斷奶仔豬除球蛋白含量差異極顯著(P<0.01)外，其余血清生化指標(biāo)與CK相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)第30天時(shí)，與CK相比， 除A組的甘油三酯、球蛋白水平及C組的白蛋白、球蛋白水平差異顯著(P<0.05)外，其余血清生化指標(biāo)與CK相比均無(wú)顯著差異(P>0.05).

表4 第15天時(shí)，牛至油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響1)

表5 第30天時(shí)，牛至油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響1)

2.5 牛至油對(duì)斷奶仔豬血常規(guī)的影響

由表6、表7可知，與CK相比，除A組斷奶仔豬在試驗(yàn)第30天時(shí)的紅細(xì)胞數(shù)極顯著提高(P<0.01)外，其余血常規(guī)與CK相比均無(wú)顯著差異(P>0.05).

表6 第15天時(shí)，牛至油對(duì)斷奶仔豬血常規(guī)的影響

表7 第30天時(shí)，牛至油對(duì)斷奶仔豬血常規(guī)的影響1)

3 討論

3.1 牛至油對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響

氧自由基是生物體中游離氧的主要存在形式，機(jī)體自身氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡是通過(guò)氧化及抗氧化系統(tǒng)的維持來(lái)實(shí)現(xiàn)，過(guò)量的氧自由基會(huì)使機(jī)體發(fā)生不同程度的損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病[10-11].在清除自由基方面，SOD和GSH-Px作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要成員發(fā)揮作用，同時(shí)也具有抗氧化損傷和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能.MDA可作為反映機(jī)體氧化程度的指標(biāo)[12].植物提取物中的酚類化合物，特別是酚類單萜(香芹酚、百里香酚)以其高抗氧化潛能而聞名，且牛至油抗氧化能力的強(qiáng)弱與其精油中香芹酚和百里香酚的含量有關(guān)[13-14].已有研究表明：在日糧中添加復(fù)合植物精油(含2.0%香芹精油、0.5%百里香精油)能夠顯著提高斷奶仔豬血清中的T-AOC，增強(qiáng)抗氧化能力[15]；在飼糧中添加400 mg·kg-1復(fù)合植物精油(含3%百里香酚、3%香芹酚)能緩解斷奶仔豬氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力[4].本研究結(jié)果顯示，與CK相比，在日糧中添加牛至油能提高斷奶仔豬血清中的T-AOC、SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA濃度.牛至油中起氧化作用的成分主要是酚酸類和萜類化合物，前者作用于自由基，通過(guò)脫氫反應(yīng)抑制機(jī)體自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)降低其活性，清除自由基達(dá)到緩解機(jī)體氧化應(yīng)激的目的，后者則利用其還原性來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體中的不飽和脂肪酸被氧化[4,16-19].表明牛至油可能是通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生及減少不飽和脂肪酸對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損傷，提高抗氧化酶活性，從而提高機(jī)體的抗氧化能力.

3.2 牛至油對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

動(dòng)物體液中的IgA、IgM、IgG等血清免疫球蛋白具有隔離病原以及激活補(bǔ)體的功能；補(bǔ)體C3、C4是體液中具有酶原活性的不耐熱球蛋白，具有吞噬細(xì)胞、炎癥介導(dǎo)、免疫黏附作用等多種非特異性免疫功能，其含量是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)[20].研究表明：牛至油具有增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能和體液免疫功能的作用[5]；在飼糧中添加復(fù)合植物精油(主要活性成分為麝香草酚、肉桂醛)可提高斷奶仔豬的免疫功能，提高血清中的IgA、 IgM、C3、C4水平[21]；在飼糧中添加200 mg·kg-1植物精油(含4.5%肉桂醛、13.5%百里香酚)可提高斷奶仔豬血清中白蛋白、IgA、IgG的水平，改善機(jī)體的免疫功能[22].本研究結(jié)果顯示，與CK相比，在日糧中添加牛至油能提高斷奶仔豬血清中補(bǔ)體的含量，尤其是IgM、IgG的含量，表明牛至油對(duì)機(jī)體免疫力的提高有較強(qiáng)的促進(jìn)作用.然而，多項(xiàng)研究表明牛至油能夠增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，但未能明確其具體的免疫機(jī)制及有效成分，原因之一是牛至油是成分復(fù)雜的化合物，提純單一成分不易，故難以進(jìn)行更為精確的試驗(yàn).

白細(xì)胞介素和干擾素等細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)等功能.IL-2可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體免疫球蛋白的分泌和IFN-γ的釋放，增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能[23-24].IL-6在細(xì)胞免疫中起重要作用，其含量升高可誘導(dǎo)受損組織愈合，并誘導(dǎo)某些補(bǔ)體成分的產(chǎn)生[25].IFN-γ可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞型分化，并刺激IL-2、IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮免疫系統(tǒng)活化作用[26].本研究結(jié)果顯示：試驗(yàn)第15天時(shí)，300～800 mg·kg-1牛至油均不同程度地提高斷奶仔豬血清中細(xì)胞因子的水平；試驗(yàn)第30天時(shí)，500、800 mg·kg-1牛至油對(duì)細(xì)胞因子水平的提高有極顯著作用.表明牛至油可提高斷奶仔豬免疫球蛋白等免疫因子的水平，從而增強(qiáng)免疫功能.

3.3 牛至油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)和血常規(guī)的影響

血清生化指標(biāo)可反映動(dòng)物機(jī)體的物質(zhì)代謝及健康水平.血清中的甘油三酯和總膽固醇水平可在一定程度上反映仔豬脂肪代謝狀況，脂肪沉積下降與這兩者水平的下降相聯(lián)系[27].本研究結(jié)果顯示，與CK相比，300、500、800 mg·kg-1牛至油組斷奶仔豬血清中的甘油三酯、總膽固醇、球蛋白水平均有下降，表明300～800 mg·kg-1牛至油均能促進(jìn)仔豬脂肪代謝和葡萄糖氧化代謝，提供機(jī)體蛋白質(zhì)合成所需的能量，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng).血清中總蛋白含量和堿性磷酸酶活性的提高可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體能量代謝和體液免疫功能[28].血清中的球蛋白水平是相對(duì)恒定的，其促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)是通過(guò)直接氧化供給機(jī)體代謝活動(dòng)所需能量來(lái)實(shí)現(xiàn).本研究結(jié)果顯示，與CK相比，300、500、800 mg·kg-1牛至油組斷奶仔豬血清中的總蛋白、白蛋白水平升高，球蛋白水平下降，表明牛至油能促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，與本研究中免疫球蛋白水平提高的結(jié)果相一致，也與本課題組前期研究結(jié)果“在日糧中添加牛至油后，斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重提高，相關(guān)血清激素指標(biāo)及IGF-Ⅰ含量升高，表明牛至油能夠促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，提高生長(zhǎng)性能[9]”一致.紅細(xì)胞作為血液循環(huán)中重要的天然免疫細(xì)胞，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答及其調(diào)控起重要作用[29-30].本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)第30天時(shí)，與CK相比，300、500、800 mg·kg-1牛至油均能不同程度地提高紅細(xì)胞數(shù)，其中，300 mg·kg-1牛至油組與CK相比差異顯著(P<0.05)，表明牛至油對(duì)仔豬紅細(xì)胞合成、造血功能和免疫功能的提高有促進(jìn)作用.谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶的活性在肝臟等器官受損時(shí)會(huì)發(fā)生明顯變化[31]；3種劑量的牛至油組中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶的活性及肌酐濃度均無(wú)明顯變化[32]，其中，肌酐濃度是反應(yīng)腎臟損傷的主要敏感指標(biāo)，表明在飼糧中添加牛至油對(duì)斷奶仔豬是安全的.

4 結(jié)論

在日糧中添加牛至油能顯著提高斷奶仔豬血清中的T-AOC和SOD活性，降低MDA濃度，提高免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、補(bǔ)體(C3、C4)和細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)的含量，改善血清生化指標(biāo)，增加紅細(xì)胞數(shù).結(jié)合本研究和前期研究結(jié)果來(lái)看，飼糧中牛至油的最適添加量為500 mg·kg-1.